Evaluation of physiological and immunological parameters in the offspring born from passively smoking rats treated with neuropeptides
- 作者: Smolyagin A.I.1, Simbirtsev A.S.2, Mikhailova I.V.1, Ermolina E.V.1, Isengulova A.A.1, Pushkareva L.A.1, Kuzmicheva N.А.1, Filippova Y.V.1, Chaynikova I.N.1, Miroshnichenko I.V.1
-
隶属关系:
- Orenburg State Medical University
- State Research Institute of Highly Pure Biopreparations
- 期: 卷 19, 编号 1-4 (2022)
- 页面: 75-79
- 栏目: Articles
- URL: https://cijournal.ru/1684-7849/article/view/623116
- DOI: https://doi.org/10.17816/CI2022221-4-12
- ID: 623116
如何引用文章
全文:
详细
The results of physiological and immunological studies of rat pups born from females who were exposed to passive smoking and exposure to tetrapeptide KK1 during pregnancy are presented. From the 1st to the 21st postnatal days, the somatic and sensorimotor development of offspring was studied using a set of tests developed at the P.K. Anokhin Institute of Normal Physiology. The level of cytokines IFN gamma and IL-6 produced by rat splenocytes was studied in culture fluid by the ELISA method. In baby rats born from passively smoking females, compared with animals born from non-smoking rats, a decrease in the weight of baby rats was found, as well as a delay in the timeliness of somatic and sensorimotor development. The introduction of the peptide KK 1 non-smoking females increases the index of timeliness of somatic and sensorimotor development.
The results obtained show an induced variant of secondary immunodeficiency in baby rats born from passively smoking rats during pregnancy. Administration of the KK1 peptide to non-smoking rats did not change the immunological parameters of the baby rats. On the contrary, the production of peptide KK1 by pregnant rats who smoked was accompanied by changes in the number of cells in lymphoid organs and the production of cytokines by splenocytes in the born rats.
全文:
Известно, что попадание табачного дыма в организм беременных животных при пассивном курении способствует интоксикации, нарушениям функций нервной и иммунной систем, задержке внутриутробного развития. Большое внимание уделяется как созданию экспериментальной модели при пассивном курении, так и поиску веществ, обладающих нейропротективным и иммуномодулирующим действием. Одним из них является препарат пептидной природы под лабораторным шифром КК1, обладающий ноотропным и психостимулирующим действием, повышающим устойчивость к стрессу и гипоксии [2, 4, 5]. Общеизвестна связь нервной, эндокринной и иммунной систем. Вместе с тем в литературе практически отсутствуют работы по влиянию данного препарата на иммунологические показатели. В связи с этим целью данной работы явилось создание экспериментальной модели для оценки влияния тетрапептида КК1 на физиологические и иммунологические показатели крысят, родившихся от пассивно куривших самок, которым в период беременности вводили данный препарат.
Материалы и методы
Экспериментальные исследования были выполнены на 20 половозрелых крысах Вистар и на 52 крысятах. Моделирование пассивного табакокурения проводили в камере без поддержания четкого режима влажности. Курящие крысы с 5-го по 20-й день гестации (ежедневно в течение 5 дней в неделю по 8 часов) подвергались фумигации табачным дымом, которая осуществлялась каждые 60 минут дымом, полученным от 1 тлеющей сигареты. Животные контрольной группы в аналогичный период помещались в камеру, вентилируемую атмосферным воздухом без табачного дыма. Начиная со 2-й недели беременности контрольным крысам вводили: I группе (5 крыс) – физраствор (0,2 мл интраназально), II гр. (5 крыс) – пептид КК1 (в дозе 40 мкг/кг/сут. 5 раз через день интраназально). Опытным курившим крысам вводили: III гр. (5 крыс) – физраствор (0,2 мл интраназально), IV гр. (5 крыс) - КК1 (в дозе 40 мкг/кг/сут. 5 раз через день интраназально). Выбор дозы и схема введения иммуномодуляторов обусловлены ранее проведенными исследованиями [3, 5]. Иммуномодулятор синтезирован и любезно предоставлен А.А. Колобовым (ФГУП Гос. НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России). Родившиеся крысята были разделены на аналогичные 4 группы. Эвтаназию крысят осуществляли дислокацией шейных позвонков под эфирным наркозом на 21-е сутки после рождения.
С 1-х по 21-е постнатальные сутки исследовано соматическое и сенсомоторное развитие потомства с помощью набора тестов, разработанных в Институте нормальной физиологии им. П.К. Анохина. Для оценки индекса своевременности соматического (ИССР) и сенсомоторного развития (ИССМР) каждого крысенка период, в течение которого у крысят проявлялись признаки развития, делился на три части: раннее, среднее и позднее время появления признака. Своевременность развития каждого признака регистрировали в баллах (2, 1 и 0 баллов соответственно). Суммарный индекс своевременности соматического и сенсомоторного развития крысенка рассчитывался путем сложения баллов всех исследуемых признаков.
В соответствии с рекомендациями [1] у крысят определяли: в крови число лейкоцитов, уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови с использованием ПЭГ-6000; в лимфоидных органах – массу и количество клеток. Продукцию цитокинов ИЛ-6 и ИФНγ исследовали в супернатантах культур спленоцитов после 48-часовой инкубации клеток при 37оС в атмосфере 5 % СО2 в полной культуральной среде (RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина). Оценивали спонтанную и индуцированную конканавалином А (Кон А) в конечной концентрации 10 мкг/мл секрецию спленоцитами ИФНγ и ИЛ-6. Уровень цитокинов исследовали в культуральной жидкости с помощью наборов (RayBio Rat IFN-gamma ELISA Kit, U.S.A., RayBio Rat IL-6 ELISA Kit, U.S.A.). Регистрацию результатов проводили на фотометре Multiskan (Labsystems, Финляндия).
Результаты исследований обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel и STATISTICA 10.0 и представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентиль), а также в виде среднеарифметического значения (M±m). Для сравнения групп использовали U-критерии Манна-Уитни, Стьюдента и χ-квадрат.
Результаты и обсуждение
При одинаковом содержании и питании животных средняя масса крысят на 21-й день от рождения была достоверно снижена у животных III гр. (31,4±1,2 г) и IV гр. (28,5±0,73 г) по сравнению с аналогичным параметром контрольной группы (37,2±0,55 г). Оценивая результаты своевременности соматического развития, установлено достоверное снижение ИССР у крысят III гр., по сравнению с контролем, следующих признаков: появление шерсти (на 82,7 %), полное обшерствление (на 65,7 %), появление верхних (на 28,3 %) и нижних резцов (на 27,9 %).
Введение пептида КК1 некурившим самкам приводило к достоверному увеличению всех восьми индексов соматического развития у крысят II гр. по сравнению с аналогичными индексами в I гр. Аналогичное введение пептида КК1 курившим самкам не выявило существенных отличий среднего ИССР (8,35±0,25) по сравнению с ИССР крысят I гр. (8,77±0,47).
Оценивая 15 параметров своевременности сенсомоторного развития, важно отметить существенное снижение всех исследованных показателей у крысят III гр. по сравнению с контролем. Отмечается наибольшее снижение следующих сенсомоторных признаков: зрительный плейсинг (на 82,7 %), движение ушей (на 62 %), класпинг (на 56,4 %), подъем и спуск по вертикальному канату (на 54,1 %), аудиторный стартл (на 49,4 %).
Введение пептида КК1 некурившим самкам приводило к увеличению 9 из 15 индексов сенсомоторного развития у крысят II гр. по сравнению с аналогичными индексами у животных контрольной I гр. Аналогичное введение пептида КК1 курившим самкам не выявило существенных отличий среднего ИССМР (16,39±0,61) по сравнению с ИССМР крысят I гр. (16,18±1,08).
Таким образом, у крысят, родившихся от пассивно куривших самок, по сравнению с животными, родившимися от некуривших крыс, установлено снижение массы крысят, а также отставание свое- временности соматического и сенсомоторного развития. Введение пептида КК1 некурившим самкам повышает выживаемость, ИССР и ИССМР у крысят.
Параллельно исследованию физиологических тестов проведено изучение иммунологических параметров крысят всех групп на 21 день от рождения, при этом в качестве контроля были использованы показатели крысят I гр., родившихся от некуривших крыс. Выявлено отсутствие значимых изменений числа лейкоцитов у крысят всех исследуемых групп. У опытных крысят III гр., родившихся от пассивно куривших самок, по сравнению с контролем, установлено снижение массы тимуса, числа тимоцитов и спленоцитов при увеличении содержания ЦИК (табл. 1). Введение некурившим крысам пептида КК1 не приводило к существенным изменениям иммунологических параметров у крысят II гр. При введении беременным курившим самкам пептида КК1 у родившихся крысят IV гр. также отмечено снижение массы тимуса, количества тимоцитов и спленоцитов при увеличении содержания ЦИК.
Таблица 1
Иммунологические параметры периферической крови и лимфоидных органов крысят Вистар (Ме, 25-й и 75-й процентиль)
Группа крысят | Лейкоциты, 109 | Масса тимуса (мг) | Тимоциты (х106) | Масса селезенки (мг) | Спленоциты (х106) | Миело- кариоциты, 106/орган | ЦИК, ЕД ОП |
I (n=18) | 4,0 | 126 [117; 137] | 167 [145; 173] | 95 [84; 111] | 118 [108; 137] | 25 [22; 28] | 25,5 [17; 45] |
II (n=12) | 5,7 | 113 [90; 124] | 175 [150; 221] | 75 [66; 100] | 98 [95; 102] | 21 [18; 23] | 26 [14; 30] |
III (n=12) | 3,6 | 95* [92; 110] | 130* [115; 135] | 103 [94; 107] | 98* [88; 110] | 21 [20; 25] | 54,5* |
IV (n=10) | 4,4 | 84* [71; 92] | 100* [96; 111] | 106 [103; 116] | 98* [90; 101] | 22 [13; 27] | 55,5* |
Примечание: * обозначены достоверные отличия (р<0,05) показателей.
Анализ количества ИФНγ, продуцируемого спленоцитами обследованных крысят, выявил только тенденцию к снижению спонтанной продукции ИФНγ у животных II гр. [162,3 (157,5-180,2) пг/мл] по сравнению с аналогичным показателем у крысят I гр. [179,0 (176,6-181,4) пг/мл]. Установлено значимое снижение индуцированной продукции ИФНγ у спленоцитов крысят II гр. [181,4 (173-186,8) пг/мл] по сравнению с крысятами I гр. [200,5 (185,5-229,7) пг/мл].
Выявлено достоверное снижение спонтанной продукции ИЛ-6 спленоцитами крысят IV гр. [50,0 (38,9-55,1) пг/мл] по сравнению с аналогичным показателем у животных I гр. [67,9 (51,6-75,2) пг/мл]. Анализ индуцированной продукции ИЛ-6 спленоцитами показал тенденцию к снижению данного показателя у животных II группы [75,3 (68,5-118,4) пг/мл] соответственно по сравнению с аналогичным показателем у крысят I гр. [91,7 (72,2-107,1) пг/мл].
Таким образом, полученные результаты свидетельствовали в пользу развития индуцированного варианта вторичного иммунодефицита у крысят, родившихся от пассивно куривших крыс во время беременности. Введение пептида КК1 некурившим крысам существенно не изменяло иммунологические параметры крысят. Напротив, введение пептида КК1 курившим беременным крысам сопровождалось изменениями количества клеток в лимфоидных органах и продукции цитокинов спленоцитами у родившихся крысят.
При обсуждении полученных результатов важно отметить, что эндогенная интоксикация самок крыс, вызываемая пассивным курением, обладает отрицательным воздействием как на клеточные сосудистые образования головного мозга с развитием церебральных дисфункций, так и на развитие иммунной системы. В основе выявленных нарушений своевременности соматического и сенсомоторного развития, а также изменений иммунологических параметров может лежать внутриутробная гипоксия и фетоплацентарная недостаточность. В пользу данного предположения свидетельствуют данные литературы о том, что внутриутробная гипоксия связана с повышением концентрации карбоксигемоглобина, содержащегося в табачном дыме, и с вазоконстрикторным действием никотина, вызывающим снижение плацентарного кровотока [8]. Фетоплацентарная недостаточность, возникающая под действием табачного дыма, способствует задержке внутриутробного развития, что проявляется в будущем в снижении массы тела у потомства [7]. Известно, что при действии токсикантов табачного дыма в наибольшей степени страдает лимфоидная линия клеток, так как их полигидроокисленные метаболиты аккумулируются в костном мозге и лимфоидных органах, вызывая гипоплазию центральных и периферических органов иммунитета. Видимый признак такого явления – это уменьшение клеточности в органах кроветворения и лимфоидных органах (селезенка, тимус), что установлено в настоящей работе. В основе положительной тенденции сдвигов физиологических и иммунологических параметров при воздействии пептида КК1 лежит возможное снижение последствий токсического действия табачного дыма за счет противовоспалительного и ноотропного эффекта данных препаратов [5].
Практическая значимость работы заключается в создании экспериментальной модели оценки влияния тетрапептида КК1 на физиологические и иммунологические параметры крысят, родившихся от пассивно куривших самок. Данная работа может являться основанием для создания модели оценки нарушений иммунной системы и разработки методологии с ее использованием при определении эффективности новых иммуномодуляторов у экспериментальных животных.
作者简介
Alexander Smolyagin
Orenburg State Medical University
编辑信件的主要联系方式.
Email: probllab.orenburg@mail.ru
md, professor, honored worker of the higher school of the russian federation, professor of the department of clinical laboratory diagnostics
俄罗斯联邦, 460000, Orenburg, Sovetskaya str., 6Andrey Simbirtsev
State Research Institute of Highly Pure Biopreparations
Email: cytokines@yandex.ru
corresponding member of the Russian academy of sciences, professor
俄罗斯联邦, St.PetersburgIrina Mikhailova
Orenburg State Medical University
Email: cytokines@yandex.ru
doctor of biological sciences, associate professor, head of the department of pharmaceutical chemistry
俄罗斯联邦, 460000, Orenburg, Sovetskaya str., 6Evgenia Ermolina
Orenburg State Medical University
Email: cytokines@yandex.ru
candidate of biological sciences, biologist of the immunological laboratory
俄罗斯联邦, 460000, Orenburg, Sovetskaya str., 6Ainagul Isengulova
Orenburg State Medical University
Email: cytokines@yandex.ru
candidate of medical sciences, associate professor, associate professor of the department of normal physiology
俄罗斯联邦, 460000, Orenburg, Sovetskaya str., 6Ludmila Pushkareva
Orenburg State Medical University
Email: cytokines@yandex.ru
postgraduate student of the department of normal physiology
俄罗斯联邦, 460000, Orenburg, Sovetskaya str., 6Natalia Kuzmicheva
Orenburg State Medical University
Email: cytokines@yandex.ru
senior lecturer of the department of pharmaceutical chemistry
俄罗斯联邦, 460000, Orenburg, Sovetskaya str., 6Yulia Filippova
Orenburg State Medical University
Email: cytokines@yandex.ru
candidate of medical sciences, associate professor of the department of pharmaceutical chemistry
俄罗斯联邦, 460000, Orenburg, Sovetskaya str., 6Irina Chaynikova
Orenburg State Medical University
Email: cytokines@yandex.ru
md, professor of the department of normal physiology
俄罗斯联邦, 460000, Orenburg, Sovetskaya str., 6Igor Miroshnichenko
Orenburg State Medical University
Email: cytokines@yandex.ru
professor, head of the department of normal physiology
俄罗斯联邦, 460000, Orenburg, Sovetskaya str., 6参考
- Волчегорский И.А., Долгушин И.И., Колесников О.Л., Цейликман В.Э. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма. – Челябинск: ЧГПУ, 2000. – C. 167. Volchegorsky I.A., Dolgushin I.I., Kolesnikov O.L., Tseilikman V.E. [Experimental modeling and laboratory evaluation of adaptive reactions of the organism]. Chelyabinsk : Chelyabinsk state pedagogical University, 2000. P.167. Russian.
- Дейко Р.Д., Штрыголь С.Ю., Колобов А.А., Симбирцев А.С. Церебропротекторные свойства и протеолитическая устойчивость пептидов, гомологичных первичной последовательности участка АКТГ15-18 (экспериментальное исследование) // Цитокины и воспаление. – 2015. – Т. 14, № 2. – С. 65-69. Deiko R.D., Shtrygol S.Yu., Kolobov A.A., Simbirtsev A.S. Cerebroprotective properties of the original peptides homologous to ACTH15-18 primary sequence (experimental study). Cytokines and Inflammation, 2015, No. 14, Р. 65-69. Russian.
- Захарчук Н.В., Невзорова В.А., Шуматов В.Б., Шестакова Н.В., Гончар Е.Ю. Субстанция в механизмах развития церебральной дисфункции при хроническом табакокурении //Тихоокеанский медицинский журнал. – 2016. – № 2. – С. 62-66. Zakharchuk N.V., Nevzorova V.A., Shumatov V.B., Shestakova N.V., Gonchar E.Yu. [Substance P in the mechanisms of the development of cerebral dysfunction in chronic tobacco Smoking] //Pacific medical journal. 2016. No. 2. P. 62-66. Russian.
- Кудина О.В., Штрыголь С.Ю., Колобов А.А., Ларьяновская Ю.Б. Влияние олигопептидов - гомологов фрагмента актг15-18 на состояние печени и надпочечников крыс на модели острого иммобилизационного стресса // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2017. – Т. 15, № 4. – C. 30-37. Kudina O.V., Shtrygol S.Yu., Kolobov A.A., Laryanovskaya Yu.B. The influence of oligopeptides - the homologues of ACTH15-18 on the liver and adrenal glands in the rats on the model of acute immobilization stress. Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy, 2017, Vol. 15, No. 4, P. 30-37. Russian.
- Толкач П.Г., Башарин В.А., Гребенюк А.Н., Колобов А.А. Оценка эффективности пептида КК1 для профилактики отдаленных нарушений функций центральной нервной системы после тяжелой интоксикации оксидом углерода в эксперименте // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии, 2015. – Т. 13. – № 3. – С. 29-34. Tolkach P.G., Basharin V.A., Grebenyuk A.N., Kolobov A.A. [Experimental assessment of the KK1 peptide effectiveness for prevention of CNS delayed impairments after acute intoxication with carbon monoxide]// Reviews of clinical pharmacology and drug therapy, 2015. – Vol.13. No. 3, P. 29-34. Russian.
- Толкач П.Г., Башарин В.А., Соловьева Т.С., Слуцкая Д.Р. Сравнительная эффективность нейропептидов КК1 и семакса для терапии поражений центральной нервной системы после тяжелого отравления оксидом углерода // Вестник Российской военно-медицинской академии. 2016. – № 2 (54). – С. 131-137. Tolkach P.G., Basharin A.V., Solovyeva T.S., Slutskaya D.R. [Comparative effectiveness of neuropeptides KK1 and semax for therapy impairment of central nervous system after acute intoxication of carbon monoxide]//Vestnik of Russian military medical Academy. 2016. No. 2 (54). P. 131-137. Russian.
- Тюлькова Е.И., Ватаева Л.А., Самойлов М.О., Отеллин В.А. Механизмы формирования реакций мозга на действие гипобарической гипоксии в различные сроки пренатального периода развития у крыс // Журнал акушерства и женских болезней. – 2010. – Т. LIX, № 4. – С. 99-110. Tiul’kova E.I., Vataeva L.A., Samoĭlov M.O., Otellin V.A. [The mechanisms of hypobaric hypoxia-induced alteration in brain development influence of gestational age at exposur]//Journal of obstetrics and women’s diseases. 2010. T. LIX. No. 4. P. 99-110. Russian.
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., & Feleszko, W. (2018). Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research and Public Health, 15(5), 1033.
补充文件
