Оценка физиологических и иммунологических показателей у потомства, родившегося от пассивно куривших крыс, получавших тетрапептид КК1
- Авторы: Смолягин А.И.1, Симбирцев А.С.2, Михайлова И.В.1, Ермолина Е.В.1, Исенгулова А.А.1, Пушкарева Л.А.1, Кузьмичева Н.А.1, Филиппова Ю.В.1, Чайникова И.Н.1, Мирошниченко И.В.1
-
Учреждения:
- ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава РФ
- ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России
- Выпуск: Том 19, № 1-4 (2022)
- Страницы: 75-79
- Раздел: Статьи
- URL: https://cijournal.ru/1684-7849/article/view/623116
- DOI: https://doi.org/10.17816/CI2022221-4-12
- ID: 623116
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Представлены результаты физиологических и иммунологических исследований крысят, родившихся от самок, которые во время беременности подвергались пассивному курению и воздействию тетрапептида КК1. С 1-х по 21-е постнатальные сутки исследовано соматическое и сенсомоторное развитие потомства с помощью набора тестов, разработанных в Институте нормальной физиологии им. П.К. Анохина. Уровень цитокинов ИФНγ и ИЛ-6, продуцируемых спленоцитами крысят, исследовали в культуральной жидкости методом ИФА. У крысят, родившихся от пассивно куривших самок, по сравнению с животными, родившимися от некуривших крыс, установлено снижение массы крысят, а также отставание своевременности соматического и сенсомоторного развития. Введение пептида КК1 некурившим самкам повышает ИССР и ИССМР.
Полученные результаты свидетельствовали в пользу развития индуцированного варианта вторичного иммунодефицита у крысят, родившихся от пассивно куривших крыс во время беременности. Введение пептида КК1 некурившим крысам существенно не изменяло иммунологические параметры крысят. Напротив, введение пептида КК1 курившим беременным крысам сопровождалось изменениями количества клеток в лимфоидных органах и продукции цитокинов спленоцитами у родившихся крысят.
Ключевые слова
Полный текст
Известно, что попадание табачного дыма в организм беременных животных при пассивном курении способствует интоксикации, нарушениям функций нервной и иммунной систем, задержке внутриутробного развития. Большое внимание уделяется как созданию экспериментальной модели при пассивном курении, так и поиску веществ, обладающих нейропротективным и иммуномодулирующим действием. Одним из них является препарат пептидной природы под лабораторным шифром КК1, обладающий ноотропным и психостимулирующим действием, повышающим устойчивость к стрессу и гипоксии [2, 4, 5]. Общеизвестна связь нервной, эндокринной и иммунной систем. Вместе с тем в литературе практически отсутствуют работы по влиянию данного препарата на иммунологические показатели. В связи с этим целью данной работы явилось создание экспериментальной модели для оценки влияния тетрапептида КК1 на физиологические и иммунологические показатели крысят, родившихся от пассивно куривших самок, которым в период беременности вводили данный препарат.
Материалы и методы
Экспериментальные исследования были выполнены на 20 половозрелых крысах Вистар и на 52 крысятах. Моделирование пассивного табакокурения проводили в камере без поддержания четкого режима влажности. Курящие крысы с 5-го по 20-й день гестации (ежедневно в течение 5 дней в неделю по 8 часов) подвергались фумигации табачным дымом, которая осуществлялась каждые 60 минут дымом, полученным от 1 тлеющей сигареты. Животные контрольной группы в аналогичный период помещались в камеру, вентилируемую атмосферным воздухом без табачного дыма. Начиная со 2-й недели беременности контрольным крысам вводили: I группе (5 крыс) – физраствор (0,2 мл интраназально), II гр. (5 крыс) – пептид КК1 (в дозе 40 мкг/кг/сут. 5 раз через день интраназально). Опытным курившим крысам вводили: III гр. (5 крыс) – физраствор (0,2 мл интраназально), IV гр. (5 крыс) - КК1 (в дозе 40 мкг/кг/сут. 5 раз через день интраназально). Выбор дозы и схема введения иммуномодуляторов обусловлены ранее проведенными исследованиями [3, 5]. Иммуномодулятор синтезирован и любезно предоставлен А.А. Колобовым (ФГУП Гос. НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России). Родившиеся крысята были разделены на аналогичные 4 группы. Эвтаназию крысят осуществляли дислокацией шейных позвонков под эфирным наркозом на 21-е сутки после рождения.
С 1-х по 21-е постнатальные сутки исследовано соматическое и сенсомоторное развитие потомства с помощью набора тестов, разработанных в Институте нормальной физиологии им. П.К. Анохина. Для оценки индекса своевременности соматического (ИССР) и сенсомоторного развития (ИССМР) каждого крысенка период, в течение которого у крысят проявлялись признаки развития, делился на три части: раннее, среднее и позднее время появления признака. Своевременность развития каждого признака регистрировали в баллах (2, 1 и 0 баллов соответственно). Суммарный индекс своевременности соматического и сенсомоторного развития крысенка рассчитывался путем сложения баллов всех исследуемых признаков.
В соответствии с рекомендациями [1] у крысят определяли: в крови число лейкоцитов, уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови с использованием ПЭГ-6000; в лимфоидных органах – массу и количество клеток. Продукцию цитокинов ИЛ-6 и ИФНγ исследовали в супернатантах культур спленоцитов после 48-часовой инкубации клеток при 37оС в атмосфере 5 % СО2 в полной культуральной среде (RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина). Оценивали спонтанную и индуцированную конканавалином А (Кон А) в конечной концентрации 10 мкг/мл секрецию спленоцитами ИФНγ и ИЛ-6. Уровень цитокинов исследовали в культуральной жидкости с помощью наборов (RayBio Rat IFN-gamma ELISA Kit, U.S.A., RayBio Rat IL-6 ELISA Kit, U.S.A.). Регистрацию результатов проводили на фотометре Multiskan (Labsystems, Финляндия).
Результаты исследований обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel и STATISTICA 10.0 и представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентиль), а также в виде среднеарифметического значения (M±m). Для сравнения групп использовали U-критерии Манна-Уитни, Стьюдента и χ-квадрат.
Результаты и обсуждение
При одинаковом содержании и питании животных средняя масса крысят на 21-й день от рождения была достоверно снижена у животных III гр. (31,4±1,2 г) и IV гр. (28,5±0,73 г) по сравнению с аналогичным параметром контрольной группы (37,2±0,55 г). Оценивая результаты своевременности соматического развития, установлено достоверное снижение ИССР у крысят III гр., по сравнению с контролем, следующих признаков: появление шерсти (на 82,7 %), полное обшерствление (на 65,7 %), появление верхних (на 28,3 %) и нижних резцов (на 27,9 %).
Введение пептида КК1 некурившим самкам приводило к достоверному увеличению всех восьми индексов соматического развития у крысят II гр. по сравнению с аналогичными индексами в I гр. Аналогичное введение пептида КК1 курившим самкам не выявило существенных отличий среднего ИССР (8,35±0,25) по сравнению с ИССР крысят I гр. (8,77±0,47).
Оценивая 15 параметров своевременности сенсомоторного развития, важно отметить существенное снижение всех исследованных показателей у крысят III гр. по сравнению с контролем. Отмечается наибольшее снижение следующих сенсомоторных признаков: зрительный плейсинг (на 82,7 %), движение ушей (на 62 %), класпинг (на 56,4 %), подъем и спуск по вертикальному канату (на 54,1 %), аудиторный стартл (на 49,4 %).
Введение пептида КК1 некурившим самкам приводило к увеличению 9 из 15 индексов сенсомоторного развития у крысят II гр. по сравнению с аналогичными индексами у животных контрольной I гр. Аналогичное введение пептида КК1 курившим самкам не выявило существенных отличий среднего ИССМР (16,39±0,61) по сравнению с ИССМР крысят I гр. (16,18±1,08).
Таким образом, у крысят, родившихся от пассивно куривших самок, по сравнению с животными, родившимися от некуривших крыс, установлено снижение массы крысят, а также отставание свое- временности соматического и сенсомоторного развития. Введение пептида КК1 некурившим самкам повышает выживаемость, ИССР и ИССМР у крысят.
Параллельно исследованию физиологических тестов проведено изучение иммунологических параметров крысят всех групп на 21 день от рождения, при этом в качестве контроля были использованы показатели крысят I гр., родившихся от некуривших крыс. Выявлено отсутствие значимых изменений числа лейкоцитов у крысят всех исследуемых групп. У опытных крысят III гр., родившихся от пассивно куривших самок, по сравнению с контролем, установлено снижение массы тимуса, числа тимоцитов и спленоцитов при увеличении содержания ЦИК (табл. 1). Введение некурившим крысам пептида КК1 не приводило к существенным изменениям иммунологических параметров у крысят II гр. При введении беременным курившим самкам пептида КК1 у родившихся крысят IV гр. также отмечено снижение массы тимуса, количества тимоцитов и спленоцитов при увеличении содержания ЦИК.
Таблица 1
Иммунологические параметры периферической крови и лимфоидных органов крысят Вистар (Ме, 25-й и 75-й процентиль)
Группа крысят | Лейкоциты, 109 | Масса тимуса (мг) | Тимоциты (х106) | Масса селезенки (мг) | Спленоциты (х106) | Миело- кариоциты, 106/орган | ЦИК, ЕД ОП |
I (n=18) | 4,0 | 126 [117; 137] | 167 [145; 173] | 95 [84; 111] | 118 [108; 137] | 25 [22; 28] | 25,5 [17; 45] |
II (n=12) | 5,7 | 113 [90; 124] | 175 [150; 221] | 75 [66; 100] | 98 [95; 102] | 21 [18; 23] | 26 [14; 30] |
III (n=12) | 3,6 | 95* [92; 110] | 130* [115; 135] | 103 [94; 107] | 98* [88; 110] | 21 [20; 25] | 54,5* |
IV (n=10) | 4,4 | 84* [71; 92] | 100* [96; 111] | 106 [103; 116] | 98* [90; 101] | 22 [13; 27] | 55,5* |
Примечание: * обозначены достоверные отличия (р<0,05) показателей.
Анализ количества ИФНγ, продуцируемого спленоцитами обследованных крысят, выявил только тенденцию к снижению спонтанной продукции ИФНγ у животных II гр. [162,3 (157,5-180,2) пг/мл] по сравнению с аналогичным показателем у крысят I гр. [179,0 (176,6-181,4) пг/мл]. Установлено значимое снижение индуцированной продукции ИФНγ у спленоцитов крысят II гр. [181,4 (173-186,8) пг/мл] по сравнению с крысятами I гр. [200,5 (185,5-229,7) пг/мл].
Выявлено достоверное снижение спонтанной продукции ИЛ-6 спленоцитами крысят IV гр. [50,0 (38,9-55,1) пг/мл] по сравнению с аналогичным показателем у животных I гр. [67,9 (51,6-75,2) пг/мл]. Анализ индуцированной продукции ИЛ-6 спленоцитами показал тенденцию к снижению данного показателя у животных II группы [75,3 (68,5-118,4) пг/мл] соответственно по сравнению с аналогичным показателем у крысят I гр. [91,7 (72,2-107,1) пг/мл].
Таким образом, полученные результаты свидетельствовали в пользу развития индуцированного варианта вторичного иммунодефицита у крысят, родившихся от пассивно куривших крыс во время беременности. Введение пептида КК1 некурившим крысам существенно не изменяло иммунологические параметры крысят. Напротив, введение пептида КК1 курившим беременным крысам сопровождалось изменениями количества клеток в лимфоидных органах и продукции цитокинов спленоцитами у родившихся крысят.
При обсуждении полученных результатов важно отметить, что эндогенная интоксикация самок крыс, вызываемая пассивным курением, обладает отрицательным воздействием как на клеточные сосудистые образования головного мозга с развитием церебральных дисфункций, так и на развитие иммунной системы. В основе выявленных нарушений своевременности соматического и сенсомоторного развития, а также изменений иммунологических параметров может лежать внутриутробная гипоксия и фетоплацентарная недостаточность. В пользу данного предположения свидетельствуют данные литературы о том, что внутриутробная гипоксия связана с повышением концентрации карбоксигемоглобина, содержащегося в табачном дыме, и с вазоконстрикторным действием никотина, вызывающим снижение плацентарного кровотока [8]. Фетоплацентарная недостаточность, возникающая под действием табачного дыма, способствует задержке внутриутробного развития, что проявляется в будущем в снижении массы тела у потомства [7]. Известно, что при действии токсикантов табачного дыма в наибольшей степени страдает лимфоидная линия клеток, так как их полигидроокисленные метаболиты аккумулируются в костном мозге и лимфоидных органах, вызывая гипоплазию центральных и периферических органов иммунитета. Видимый признак такого явления – это уменьшение клеточности в органах кроветворения и лимфоидных органах (селезенка, тимус), что установлено в настоящей работе. В основе положительной тенденции сдвигов физиологических и иммунологических параметров при воздействии пептида КК1 лежит возможное снижение последствий токсического действия табачного дыма за счет противовоспалительного и ноотропного эффекта данных препаратов [5].
Практическая значимость работы заключается в создании экспериментальной модели оценки влияния тетрапептида КК1 на физиологические и иммунологические параметры крысят, родившихся от пассивно куривших самок. Данная работа может являться основанием для создания модели оценки нарушений иммунной системы и разработки методологии с ее использованием при определении эффективности новых иммуномодуляторов у экспериментальных животных.
Об авторах
Александр Иванович Смолягин
ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава РФ
Автор, ответственный за переписку.
Email: probllab.orenburg@mail.ru
д.м.н., профессор, заслуженный работник высшей школы РФ, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики
Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6Андрей Семенович Симбирцев
ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России
Email: cytokines@yandex.ru
член-корреспондент РАН, профессор
Россия, г. Санкт-ПетербургИрина Валерьевна Михайлова
ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава РФ
Email: cytokines@yandex.ru
д.б.н., доцент, заведующий кафедрой фармацевтической химии
Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6Евгения Вячеславовна Ермолина
ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава РФ
Email: cytokines@yandex.ru
к.б.н., биолог иммунологической лаборатории
Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6Айнагуль Акимкиреевна Исенгулова
ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава РФ
Email: cytokines@yandex.ru
к.м.н., доцент, доцент кафедры нормальной физиологии
Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6Людмила Анатольевна Пушкарева
ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава РФ
Email: cytokines@yandex.ru
аспирант кафедры нормальной физиологии
Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6Наталья Александровна Кузьмичева
ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава РФ
Email: cytokines@yandex.ru
старший преподаватель кафедры фармацевтической химии
Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6Юлия Владимировна Филиппова
ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава РФ
Email: cytokines@yandex.ru
к.м.н., доцент кафедры фармацевтической химии
Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6Ирина Николаевна Чайникова
ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава РФ
Email: cytokines@yandex.ru
д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии
Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6Игорь Васильевич Мирошниченко
ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава РФ
Email: cytokines@yandex.ru
д.м.н., профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии
Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6Список литературы
- Волчегорский И.А., Долгушин И.И., Колесников О.Л., Цейликман В.Э. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма. – Челябинск: ЧГПУ, 2000. – C. 167. Volchegorsky I.A., Dolgushin I.I., Kolesnikov O.L., Tseilikman V.E. [Experimental modeling and laboratory evaluation of adaptive reactions of the organism]. Chelyabinsk : Chelyabinsk state pedagogical University, 2000. P.167. Russian.
- Дейко Р.Д., Штрыголь С.Ю., Колобов А.А., Симбирцев А.С. Церебропротекторные свойства и протеолитическая устойчивость пептидов, гомологичных первичной последовательности участка АКТГ15-18 (экспериментальное исследование) // Цитокины и воспаление. – 2015. – Т. 14, № 2. – С. 65-69. Deiko R.D., Shtrygol S.Yu., Kolobov A.A., Simbirtsev A.S. Cerebroprotective properties of the original peptides homologous to ACTH15-18 primary sequence (experimental study). Cytokines and Inflammation, 2015, No. 14, Р. 65-69. Russian.
- Захарчук Н.В., Невзорова В.А., Шуматов В.Б., Шестакова Н.В., Гончар Е.Ю. Субстанция в механизмах развития церебральной дисфункции при хроническом табакокурении //Тихоокеанский медицинский журнал. – 2016. – № 2. – С. 62-66. Zakharchuk N.V., Nevzorova V.A., Shumatov V.B., Shestakova N.V., Gonchar E.Yu. [Substance P in the mechanisms of the development of cerebral dysfunction in chronic tobacco Smoking] //Pacific medical journal. 2016. No. 2. P. 62-66. Russian.
- Кудина О.В., Штрыголь С.Ю., Колобов А.А., Ларьяновская Ю.Б. Влияние олигопептидов - гомологов фрагмента актг15-18 на состояние печени и надпочечников крыс на модели острого иммобилизационного стресса // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2017. – Т. 15, № 4. – C. 30-37. Kudina O.V., Shtrygol S.Yu., Kolobov A.A., Laryanovskaya Yu.B. The influence of oligopeptides - the homologues of ACTH15-18 on the liver and adrenal glands in the rats on the model of acute immobilization stress. Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy, 2017, Vol. 15, No. 4, P. 30-37. Russian.
- Толкач П.Г., Башарин В.А., Гребенюк А.Н., Колобов А.А. Оценка эффективности пептида КК1 для профилактики отдаленных нарушений функций центральной нервной системы после тяжелой интоксикации оксидом углерода в эксперименте // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии, 2015. – Т. 13. – № 3. – С. 29-34. Tolkach P.G., Basharin V.A., Grebenyuk A.N., Kolobov A.A. [Experimental assessment of the KK1 peptide effectiveness for prevention of CNS delayed impairments after acute intoxication with carbon monoxide]// Reviews of clinical pharmacology and drug therapy, 2015. – Vol.13. No. 3, P. 29-34. Russian.
- Толкач П.Г., Башарин В.А., Соловьева Т.С., Слуцкая Д.Р. Сравнительная эффективность нейропептидов КК1 и семакса для терапии поражений центральной нервной системы после тяжелого отравления оксидом углерода // Вестник Российской военно-медицинской академии. 2016. – № 2 (54). – С. 131-137. Tolkach P.G., Basharin A.V., Solovyeva T.S., Slutskaya D.R. [Comparative effectiveness of neuropeptides KK1 and semax for therapy impairment of central nervous system after acute intoxication of carbon monoxide]//Vestnik of Russian military medical Academy. 2016. No. 2 (54). P. 131-137. Russian.
- Тюлькова Е.И., Ватаева Л.А., Самойлов М.О., Отеллин В.А. Механизмы формирования реакций мозга на действие гипобарической гипоксии в различные сроки пренатального периода развития у крыс // Журнал акушерства и женских болезней. – 2010. – Т. LIX, № 4. – С. 99-110. Tiul’kova E.I., Vataeva L.A., Samoĭlov M.O., Otellin V.A. [The mechanisms of hypobaric hypoxia-induced alteration in brain development influence of gestational age at exposur]//Journal of obstetrics and women’s diseases. 2010. T. LIX. No. 4. P. 99-110. Russian.
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., & Feleszko, W. (2018). Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research and Public Health, 15(5), 1033.
Дополнительные файлы
