Dependence of cytokine concentration in coproextracts in children with inflammatory bowel diseases on disease activity

Толық мәтін

Обоснование

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) являются иммуноопосредованными воспалительными заболеваниями, включающими болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК). Более 6,8 млн человек в мире страдают этими заболеваниями [1]. Этиологическими факторами ВЗК признаны генетические, микробиологические (длительное нарушение микробиоты кишечника), факторы окружающей среды и нарушение баланса врождённого и адаптивного иммунитета. Ключевым моментом в иммунопатогенезе ВЗК считается инфильтрация стенки кишечника различными иммунокомпетентными клетками и продукция ими провоспалительных цитокинов [2]. Однако цитокиновая сеть охватывает не только клетки иммунной системы. Эпителиальные, эндотелиальные, мезенхимальные клетки, клетки печени, нервной и эндокринной систем также активно участвуют в продукции и рецепции цитокинов, внося вклад в воспалительные реакции. Цитокины являются универсальным языком межклеточного общения. Они осуществляют связь между различными клетками организма и координируют эффекты врождённого и адаптивного иммунитета [3]. Для ВЗК типично вовлечение в патологический процесс провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин (IL)-1β, фактор некроза опухолей (TNF). Традиционно БК связывают с Th1- и Th17-типом иммунного ответа и продукцией IL-12, IL-23, IL-17 и интерферона-γ (IFN-γ). Для ЯК более типичным является Th2-тип ответа и продукция IL-4, IL-5 и IL-13 [1]. Однако позже было показано, что существуют и обратные зависимости. На данный момент считается, что ключевую роль играет именно дисбаланс в иммунорегуляторных механизмах, приводящий к нарушению контроля за продукцией цитокинов на местном уровне. Дисфункция местного иммунитета кишечника и дисбаланс цитокиновой сети рассматриваются как основное звено иммунопатогенеза ВЗК, поддерживающее воспаление в стенке кишечника [4]. Изучение местного иммунитета кишечника при ВЗК представляет достаточно сложную задачу, так как исследования на мышиных моделях не совсем точно отражают ситуацию в человеческом организме, а исследование биоптатов кишечника больного человека весьма травматично и чревато осложнениями, поскольку стенка кишечника и без того поражена воспалением [5]. Следует обратить внимание, что у детей отмечается более агрессивное течение ВЗК по сравнению со взрослыми, а иммунные механизмы патогенеза ВЗК изучены гораздо хуже. Ранее нами была показана возможность определять цитокины в копроэкстрактах больных ВЗК для оценки состояния местного иммунитета кишечника. Уровень основных исследованных цитокинов у детей с ВЗК был значимо повышен по сравнению с контрольной группой [6].

Цель исследования — сопоставление уровней 14 цитокинов в копроэкстрактах педиатрических пациентов с ВЗК с активностью заболевания.

Материалы и методы

В простое сравнительное исследование были включены 83 ребенка (48 мальчиков и 35 девочек) в возрасте 6–17 лет, в том числе 30 детей с БК (группа 1), 33 ребенка с ЯК (группа 2) и 20 условно здоровых детей, составивших контрольную группу (группа 3). Диагноз у детей групп 1 и 2 был установлен на основании анамнеза, клинико-лабораторных, эндоскопических и гистологических критериев Леннарда-Джонса. Фенотип заболевания определяли на основе Монреальской классификации. Длительность заболевания на момент обследования варьировала от 1 мес. до 12 лет, в среднем составила 4,3 года. Активность заболевания у детей с БК оценивали с помощью индекса PCDAI (Pediatric Chron’s Disease Activity Index), активность ЯК оценивали на основании индекса PUCAI (Pediatric Ulcerative Colitis Activity Index). Исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом НМИЦ НЦЗД (№ 14 от 19.11.2018).

Водно-солевой копроэкстракт получали смешивая один объём фекалий с тремя объёмами забуференного фосфатами физиологического раствора, перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Цитокины определяли в надосадочной жидкости. Для контрольной группы разведение биологического материала было 1:4, а для групп 1 и 2 конечное разведение составило 1:40, так как ранее было показано, что у больных ВЗК уровень цитокинов существенно выше [6].

Концентрацию 14 цитокинов (IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, IFN-γ и TNF) в водно-солевых копроэкстрактах определяли с помощью мультиплексного метода (MagPix, BioRad, США) с использованием коммерческих тест-систем Th17-Plex, согласно инструкции производителя.

Полученные результаты были исследованы на предмет нормальности распределения методом Колмогорова– Смирнова. В случае подтверждения нормальности распределения признака применяли параметрическую статистику с вычислением средней арифметической и стандартной ошибки (М±SE), а в случае неподтверждения нормальности распределения использовали непараметрические методы с вычислением медианы, первой и третьей квартили [Me (LQ–HQ)]. Различия оценивали методом Манн–Уитни, значимыми считали различия при p <0,05. Корреляции рассчитывали методом Пирсона.

Результаты

На основании значений индексов активности заболевания больные дети групп 1 и 2 были разделены на подгруппы (табл. 1). Коэффициент корреляции между клиническим индексом активности БК PCDAI и эндоскопическим индексом активности заболевания SES-CD составил 0,353, что свидетельствует о слабой положительной связи, а для индекса активности ЯК PUCAI и соответствующего эндоскопического индекса UCEIS — 0,704, что свидетельствует о сильной положительной связи.

 

Таблица 1. Распределение детей по степени активности заболевания

Table 1. Children distribution according to the degree of disease activity

Клиническая активность Clinical activity	Болезнь Крона (группа 1) Crohn’s disease (group 1)		Язвенный колит (группа 2) Ulcerative colitis (group 2)
	Количество детей Number of children	Индекс PCDAI Index PCDAI	Количество детей Number of children	Индекс PUCAI Index PUCAI
Ремиссия Remission	9	8,33±0,83	8	6,88±0,86
Низкая активность Low activity	–	–	9	21,67±2,36
Умеренная активность Moderate activity	14	20,54±1,72	11	40,45±1,75
Высокая активность High activity	7	46,79±3,38	5	66±1,86

 

Результаты определения цитокинов в копроэкстрактах здоровых детей представлены в табл. 2. Уровень цитокинов в копроэкстрактах здоровых детей невысокий, но вполне определяемый. Для пациентов групп 1 и 2 уровни цитокинов были подсчитаны в зависимости от активности заболевания и представлены на графиках. Следует сразу подчеркнуть, что в копроэкстрактах больных из групп 1 и 2 уровни цитокинов превышали соответствующие уровни цитокинов группы сравнения в 5–30 раз, то есть для всех больных ВЗК детей различия в уровнях всех исследованных цитокинов были высоко значимы по сравнению с группой 3 (p <0,000). Поскольку уровни разных цитокинов различались иногда в десятки раз, цитокины на графиках были сгруппированы в соответствии с диапазоном полученных значений для удобства графического представления.

 

Таблица 2. Концентрация цитокинов в копроэкстрактах здоровых детей, пг/мл

Table 2. Cytokine concentration in coproextracts of healthy children (pg/ml)

Цитокин Cytokine	Концентрация, Me (LQ–HQ) Concentration, Me (LQ–HQ)
IL-1β	38 (32–49,25)
IL-4	34,52 (25,18–50,37)
IL-6	44 (39,25–48,75)
IL-10	59,65 (45,17–67,65)
IL-17A	13,85 (9,37–18,64)
IL-17F	64,74 (53,92–95,63)
IL-21	389,34 (255,98–481,12)
IL-22	53,03 (24,57–71,13)
IL-23	92,96 (92,96–318,22)
IL-25	19,74 (17,8–22,95)
IL-31	45,39 (38,33–63,92)
IL-33	42,43 (22,35–57,55)
IFN-γ	60,49 (48,39–70,9)
TNF	3,33 (0,57–7,33)

 

На рис. 1, а видно, что уровень провоспалительных цитокинов в группе 1 (БК) прогрессивно снижался от уровня с высокой активностью заболевания до уровня в ремиссии. Для TNF такое снижение составило с 169,16 (153,35–178,25) пг/мл до 84,88 (78,3–92,85) пг/мл, p <0,05. Для детей с ЯК (группа 2, см. рис. 1, b) аналогичное снижение составило с 110,5 (78,4–126,2) пг/мл до 71,65 (66,83–85,13) пг/мл, p <0,05. Похожая динамика была обнаружена для IL-17A. У детей с БК (группа 1) выявлено снижение с 162,17 (143,7–184,27) пг/мл до 84,07 (65,28–91,43) пг/мл, p <0,05, а у детей с ЯК (группа 2) — с 119,26 (96,95–126,28) пг/мл до 73,28 (60,36–82,58) пг/мл, p <0,05. Для противовоспалительного цитокина IL-10 в группе 1 выявлена обратная зависимость, он нарастал с уменьшением активности заболевания с 194,78 (143,01–246,36) пг/мл до 287,85 (279,26–335,29) пг/мл, p <0,05. Обнаружена отрицательная корреляция средней силы между индексом PCDAI и уровнем IL-10 (r= –0,401). В группе 2 выявлена другая тенденция: IL-10 сначала нарастал с уровня высокой активности 143,01 (130,51–175,01) пг/мл до уровня низкой активности 207,02 (204,76–232,9) пг/мл, p <0,05, а в подгруппе с ремиссией значимо снизился до 152,76 (107,58–196,2) пг/мл, p <0,05. При этом уровень IL-25, цитокина, выделяемого повреждёнными клетками эпителия, практически не зависел от активности клинических проявлений и колебался в диапазоне 225–250 пг/мл в обеих группах.

 

Рис. 1. Изменение уровней про- и противовоспалительных цитокинов в копроэкстрактах детей с воспалительными заболеваниями кишечника в зависимости от клинической активности заболевания: а — болезнь Крона; b —язвенный колит.

Fig. 1. Changes in the levels of pro- and anti-inflammatory cytokines in coproextracts of children with inflammatory bowel diseases depending on the disease clinical activity: a — Crohn’s disease; b — ulcerative colitis.

 

Представленные на рис. 2 уровни провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, IL-6 и IL-17F, по мере уменьшения активности заболевания постепенно снижались, составив для IL-1β в группе 1 при высокой активности 471,85 (391,32–498,17) пг/м и снизившись в ремиссии до 291,02 (284,5–307,19) пг/мл, p <0,05. В группе 2 (см. рис. 2, b) обнаружено такое же снижение с 481,4 (372–567,08) пг/мл до 247,03 (241,03–253,3) пг/мл, p <0,05. Выявлена положительная корреляция средней силы между индексом PUCAI и уровнем IL-1β (r=0,476). Снижение уровня IL-6 было не столь выражено. В группе 1 его уровень снизился с 458,29 (360,5–481,07) пг/мл до 376,88 (374,1–400,22) пг/мл, а в группе 2 с 389,6 (374,1–422,91) пг/мл до 333,5 (320,2–353,75) пг/мл. Более выраженная динамика отмечена для IL-17F. В группе 1 его уровень снизился с 564,41 (474,93–595,8) пг/мл до 424,52 (404,37–455,81) пг/мл, p <0,05, а в группе 2 с 547,48 (434,06–581,04) пг/мл до 396,69 (357,04–413,85) пг/мл, p <0,05. Обнаружена положительная корреляция средней силы между индексом PUCAI и уровнем IL-17F (r=0,493). Обращает внимание то, что уровень IFN-γ не зависел от активности заболевания и незначимо колебался в диапазоне 240–280 пг/мл в обеих группа. Интересно, что для IL-4 в исследованных группах пациентов выявлены разнонаправленные изменения. Если у больных ЯК его концентрация прогрессивно снижалась по мере снижения активности с 413,83 (334,9–449,14) пг/мл до 275,7 (212,73–334,9) пг/мл, p <0,05 в ремиссии, то при БК она, напротив, нарастала с 411,86 (375,7–449,14) пг/мл до 569,58 (461,53–746,62) пг/мл, p <0,05. Выявлена отрицательная корреляция средней силы между индексом PCDAI и уровнем IL-4 (r=–0,452).

 

Рис. 2. Зависимость уровней провоспалительных цитокинов в копроэкстрактах детей с воспалительными заболеваниями кишечника от клинической активности заболевания: a — болезнь Крона; b — язвенный колит.

Fig. 2. Dependence of the proinflammatory cytokines levels in coproextracts of children with inflammatory bowel diseases on the disease clinical activity: a — Crohn’s disease; b — ulcerative colitis.

 

На рис. 3 представлены результаты определения уровня цитокинов, отвечающих за репарацию эпителия. Они демонстрируют сходные тенденции. Так, концентрация IL-22 по мере снижения активности заболевания нарастала с 375,30 (245,73–391,59) пг/мл до 532,13 (374,48–721,1) пг/мл, p <0,05 в группе 1 и с 385,89 (294,65–431,99) пг/мл до 796,91 (515,05–1247,44) пг/мл, p <0,05 в группе 2. Уровень IL-33 также возрастал с 143,19 (107,13–173,66) пг/мл до 358,12 (273,6–490,77) пг/мл, p <0,05 в группе 1 и с 173,24 (107,13–235,2) пг/мл до 484,97 (407,88–679,26) пг/мл, p <0,05 в ремиссии в группе 2. Выявлены отрицательные корреляции средней силы между индексом PCDAI и уровнем IL-22 (r=–0,409), а для уровня IL-33 r=–0,467.

 

Рис. 3 Изменение уровней цитокинов, ответственных за репарацию эпителия, в копроэкстрактах детей с воспалительными заболеваниями кишечника в зависимости от клинической активности заболевания: a — болезнь Крона; b — язвенный колит.

Fig. 3 Changes in the cytokines levels responsible for epithelial repair in coproextracts of children with inflammatory bowel diseases depending on the disease clinical activity: a — Crohn’s disease; b — ulcerative colitis.

 

Результаты исследования концентрации IL-23, IL-31 и IL-21 представлены на рис. 4. Уровень IL-23 демонстрировал тенденцию к снижению по мере снижения активности заболевания с 6003,75 (5737,8–6269,7) пг/мл до 5555,22 (4886,4–5950,5) пг/мл в группе 1 и с 5737,68 (5311,8–6163,2) пг/мл до 5311,95 (4886,4–5418,3) пг/мл в группе 2, однако различия оказались незначимыми. Концентрация IL-31 в группе 1 снизилась с 1579,14 (903,15–1991,91) пг/мл до 1051,12 (838,95–1178,67) пг/мл, p <0,05, а в группе 2 снижение с 733,35 (499,29–923,56) пг/мл до 499,29 (377,52–669,135) пг/мл проявилось лишь как тенденция. Уровень IL-21 не зависел от активности заболевания и колебался в диапазоне от 2703,27 до 3489,02 пг/мл в обеих группах.

 

Рис. 4. Зависимость уровней IL-21, IL-23 и IL-31 в копроэкстрактах детей с воспалительными заболеваниями кишечника от клинической активности заболевания: a — болезнь Крона; b — язвенный колит.

Fig. 4. Dependence of IL-21, IL-23 and IL-31 levels in coproextracts of children with inflammatory bowel diseases on the disease clinical activity: a — Crohn’s disease; b — ulcerative colitis.

 

Обсуждение

В результате проведённых исследований было показано, что все 14 изученных нами цитокинов вовлечены у детей в иммунопатогенез ВЗК. Все они были значимо повышены по сравнению с результатами обследования группы здорового контроля. Важно отметить, что провоспалительные цитокины, такие как TNF, IL-1β и IL-6, последовательно снижались в копроэкстрактах больных БК и ЯК по мере снижения активности заболевания. Это свидетельствует о том, что снижение клинических индексов, по которым оценивается активность ВЗК, соответствует снижению активности воспаления на местном уровне. При этом уровень IL-23 был очень высоким при обеих нозологиях, хотя и демонстрировал тенденцию к снижению по мере снижения активности заболевания. Известно, что комбинация IL-6, IL-23 и IL-1β способствует индукции Th17-ответа. Действительно, уровни IL-17A и IL-17F у обследованных детей были повышены в 8–10 раз относительно уровней контрольной группы при высокой активности заболевания, тогда как в ремиссии такое превышение было в 5–6 раз. Связывание IL-17 с рецептором регулирует функции кишечного барьера и способствует высвобождению провоспалительных цитокинов, поддерживающих воспаление [7]. Таким образом, выявленное нами снижение уровней IL-17 в копроэкстрактах больных ВЗК в ремиссии также свидетельствует о снижении активности местного воспаления. Однако даже в стадии ремиссии цитокины, производимые Th17, остаются значимо повышенными, поддерживая патологическое воспаление в кишечнике, что было показано и другими исследователями [8]. Такой цитокин, как IL-21, считается маркером Tfh, однако его также производят и Th17-клетки, поэтому сохраняющийся высокий уровень этого цитокина, независимо от активности заболевания, также свидетельствует о сохранении активности Th17 даже в стадии ремиссии. Наши данные об уровне IL-21 согласуются с результатами, полученными при исследовании биоптатов больных БК и ЯК, где показано, что этот цитокин был значимо повышен и его уровень не коррелировал ни с активностью заболевания, ни с проводимым лечением [9].

Согласно исследованию цитокинов-маркеров Th1/Th2 субпопуляций (IFN-γ и IL-4), уровень IFN-γ практически не зависит от стадии заболевания и значимо не различается в группах с БК и ЯК. Однако если оценить соотношение IFN-γ/IL-4 в копрофильтратах, то в группе здоровых этот коэффициент равен 1,45, что свидетельствует о преобладании IFN-γ. При высокой активности в группах 1 и 2 он оказался сниженным до 0,67 (преобладание IL-4), а в стадии ремиссии у больных ЯК он повысился до 0,87, хотя был всё ещё ниже, чем у здоровых, а в группе БК продолжил снижаться до 0,48. Возможно, такие различия отражают разное участие Th1- и Th2-субпопуляций в патогенезе этих нозологий [10]. Если учесть, что для БК типичен Th1-ответ, то снижение индекса IFN-γ/IL-4 у больных в ремиссии говорит о подавлении такого ответа, тогда как в группе больных ЯК, для которых типичен Th2-ответ, напротив, повышение этого индекса в ремиссии говорит о подавлении этого ответа. Обе ситуации следует рассматривать как положительные.

Цитокины IL-22 и IL-33 ответственны за репарацию эпителиальных клеток. В частности, IL-22 поддерживает функции эпителиального барьера, способствует продукции слизи и антимикробных пептидов [11]. IL-33 защищает от воспаления в кишечнике, способствуя индукции Treg и синтезу амфирегулина, который отвечает за репарацию эпителия [12]. Повышение уровней этих цитокинов по мере снижения активности заболевания может свидетельствовать об усилении процессов репарации кишечного эпителия. Методом иммуногистохимии в биоптатах больных БК было также показано нарастание уровня IL-33 после лечения пациентов с помощью анти-TNF-препаратов и снижения активности заболевания [9].

Известно, что IL-25 активно секретируется повреждёнными эпителиальными клетками, сигнализируя иммунокомпетентным клеткам о необходимости защиты. Более того, оказалось, что IL-25 может подавлять активность Th17 [13]. При исследовании кишечных биоптатов взрослых, больных ВЗК, обнаружено снижение экспрессии РНК для IL-25 и экспрессии самого цитокина [14], что не соответствует нашим данным, выявившим повышение уровня IL-25 в копроэкстрактах больных ВЗК. Такие различия могут быть связаны с тем, что при биопсии выбирают наиболее поражённый участок кишечника. В результате длительной персистенции воспаления в этом участке способность эпителиальных клеток к синтезу IL-25, как и жизнеспособность самих этих клеток, может быть нарушена. При исследовании концентрации цитокина в копроэкстракте мы имеем суммарный уровень, который может быть обеспечен повреждением эпителиальных клеток по краю очага воспаления, недавно вовлечённых в воспаление и способных ещё синтезировать IL-25. Более того, оказалось, что IL-25 способствует снижению продукции IFN-γ, TNF и IL-17A за счёт усиления продукции IL-10 [15]. Таким образом, повышенный уровень IL-25 следует рассматривать как протективный.

Противовоспалительный цитокин IL-10 продуцируется преимущественно субпопуляцией Treg и направлен на подавление активности воспаления, поэтому повышение его уровня по мере снижения активности воспалительного процесса следует рассматривать как позитивный факт.

Заключение

Несмотря на всю вышеперечисленную позитивную динамику снижения уровней провоспалительных цитокинов и повышение концентрации противовоспалительных цитокинов по мере снижения активности ВЗК, следует подчеркнуть, что у детей даже в периоде ремиссии уровни исследованных цитокинов значимо отличались от соответствующих уровней группы здорового контроля. Важно, что все больные дети находились на плановой терапии в соответствии с различными протоколами. В терапии были использованы: 5-аминосалициловая кислота (месалазин), азатиоприн, глюкокортикоиды, генно-инженерные биологические препараты и различные комбинации этих препаратов. При этом даже при достижении ремиссии уровни цитокинов в копроэкстрактах были значимо повышены. Следовательно, при достижении клинической ремиссии на фоне лечения не достигается полной иммунологической ремиссии. Активность воспаления при лечении ВЗК может снизиться до субклинического уровня, но патологический процесс не исчезает и может быть выявлен иммунологическими методами. Из этого можно сделать два вывода. Во-первых, известные на данный момент схемы лечения ВЗК не излечивают болезнь, а лишь снижают её активность, и при отмене терапии крайне высока вероятность обострения заболевания. Во-вторых, остаётся актуальной задача более детального изучения иммунопатогенеза ВЗК и поиска принципиально новых подходов к терапии этих тяжёлых заболеваний.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: А.П. Топтыгина — тестирование цитокинов, написание статьи; Е.Л. Семикина — сбор и обработка биологического материала, обсуждение результатов; В.С. Цветкова — ведение пациентов, статистическая обработка результатов; А.Е. Красновидова — ведение пациентов, анализ литературы; А.С. Потапов — концепция работы, редактирование статьи.

Информированное согласие на публикацию. Авторы получили письменное согласие законных представителей пациентов на публикацию медицинских данных.

Additional information

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work). A.P. Toptygina — cytokine testing, wrote the manuscript; E.L. Semikina — collection and processing of biological material, discussion of results; V.S. Tsvetkova — patient supervision, statistical processing of results; A.E. Krasnovidova — patient supervision, analyze the literature data; A.S. Potapov — generated themes and ideas and edited the manuscript.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patients’ parents for publication of relevant medical information within the manuscript.

Авторлар туралы

Anna Toptygina

G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology; Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia;

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: toptyginaanna@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-9981-4762
SPIN-код: 8523-5018

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Ресей, Moscow; Moscow

Elena Semikina

National Medical Research Center of Children’s Health; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: semikinaelena@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8923-4652
SPIN-код: 3647-4967

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Ресей, Moscow; Moscow

Valeria Tsvetkova

National Medical Research Center of Children’s Health

Email: tsvetkova.valerie@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8162-2957
SPIN-код: 2723-8402

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Ресей, Moscow

Anastasia Krasnovidova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: dr.krasnovidova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0250-343X
SPIN-код: 2979-7431
Ресей, Moscow

Alexander Potapov

National Medical Research Center of Children’s Health; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: potapov@nczd.ru
ORCID iD: 0000-0003-4905-2373
SPIN-код: 9507-7419

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Ресей, Moscow; Moscow

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар