EFFECT OF THE HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 L2 PEPTIDE ON THE CYTOKINE PROFILE OF DENDRITIC CELLS IN VITRO


Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

The human papillomavirus (HPV) is an etiological factor and a biological carcinogen in tumor lesions and cancer.  Currently, many possible mechanisms of immune evasion of are known. There is still a need to expand early methods for diagnosing papillomavirus infection and finding effective treatments. The results of a study of the spontaneous and induced amount of cytokines produced by dendritic cells in vitro in response to stimulation with the synthesized L2 peptide of the human papillomavirus type 16 are presented.It was found that the interaction of human blood-derived dendritic cells with the minor capsid peptide L2 of HPV type 16 disrupts the synthesis of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines, which leads to an imbalance in the immune response, and may indicate an effective mechanism for HPV evasion from the inflammatory response and the formation of an immunodeficiency state.

Full Text

Введение

Инфицирование вирусом папилломы человека (ВПЧ) является одним из факторов канцерогенеза. У большинства людей при заражении ВПЧ защитные противовирусные механизмы оказываются эффективными и происходит элиминация возбудителя из организма, только часть инфицированных приобретают хроническую форму папилломавирусной инфекции, у некоторых развиваются онкологические заболевания. Первыми ВПЧ поражает клетки кожи и слизистых оболочек, при проникновении вируса происходит запуск воспалительных иммунных реакций, в которых принимают участие интерлейкины, хемокины, факторы роста, интерфероны, а также продуцирующие их клетки (кератиноциты, макрофаги, клетки Лангерганса, фибробласты, эндотелиоциты, лимфоциты) при участии рецепторного аппарата [11]. От состояния иммунной системы индивидуума зависит как инфицирование ВПЧ, так и развитие определенной клинической формы инфекции [6].

В процессе эволюции папилломавирусы (ПВ) приобрели биологические и иммунологические особенности, необходимые для их облигатного эпителиотропного жизненного цикла. Папилломавирусы – одни из представителей онкогенных вирусов с двухцепочечной ДНК без оболочки с геномом, кодирующим ранние (E) и поздние (L) белки. Первичное инфицирование базальных эпителиальных клеток, спровоцированное микротравмой, позволяет вирусу сохраняться в них в низких титрах, репликация вируса при этом тесно связана с дифференцировкой многослойного эпителия. Продукция капсидных белков L1 и L2 и инкапсуляция вирусного генома происходят только в верхних слоях эпителия, далее инфекционные вирионы отделяются с отслоившимися клетками поверхностного эпителия. Персистенция ВПЧ в локальном очаге инфекции в условиях отсутствия системной виремии препятствует доступу антигенпрезентирующих клеток и обеспечивает нелитический цикл репликации вируса [8].

При попадании ВПЧ в организм активируются защитные функции врожденного иммунитета. Распознавание чужеродных нуклеиновых кислот происходит с помощью толл-подобных рецепторов (TLR4, TLR7, TLR8, TLR9), расположенных на клетках Лангерганса, макрофагах и других иммунных клетках. Как только инфекция ВПЧ выходит из-под контроля врожденного иммунитета, адаптивный иммунитет становится ведущим при уничтожении инфицированных ВПЧ эпителиальных клеток шейки матки посредством системного иммунного ответа, осуществляемого с участием дендритных клеток (ДК) в регионарных лимфоидных органах, или посредством местного иммунного ответа. ВПЧ обладает способностью обходить иммунную систему, данный процесс обусловлен локальной иммуносупрессией, а также отсутствием виремии и цитолиза, также известна способность ВПЧ тормозить миграцию и активацию клеток Лангерганса [2].

Важную физиологическую функцию, в частности ответ на воздействие патогена, выполняют цитокины. В настоящее время уделяется большое внимание роли цитокинов в реализации регуляторных иммунных процессов. Цитокины относятся к классу полипептидных медиаторов клеток иммунной системы, посредством которых происходит межклеточные взаимодействия [12].

Интерлейкины включаются во все этапы системного и локального иммунного ответа: распознавание воспалительных антигенов; активацию антигенпрезентирующих клеток; миграцию иммунокомпетентных клеток к участку воспаления; генерацию практически всех клонов цитотоксических клеток [14].

Показано увеличение провоспалительных цитокинов IL-8, снижение противовоспалительного IL-10 при исследовании локального иммунного ответа на инфицирование ВПЧ высокого канцерогенного риска в цервикальной слизи у женщин и эякуляте у мужчин. По данным литературы отмечалась низкая концентрация антиапоптического IL-1β и TNF-a, значение IFN-g у инфицированных ВПЧ пациентов превышало нормальный уровень, а содержание IFN-a практически не отличалось от контрольной группы. Таким образом, разнонаправленные изменения концентрации цитокинов и интерферонов способствуют длительной персистенции ВПЧ, снижая возможность элиминации вируса, замедляя процесс апоптоза, что приводит к развитию интраэпителиальных поражений [4].

Наличие гибких свойств ДК и прямое участие в регуляции воспаления, характеризует их как экспрессивные регуляторы эффективности клеточного иммунитета. ДК являются источниками цитокинов, как  важных стимуляторов первичного иммунного ответа [5]. ДК являются ключевым звеном в иммунном ответе на патоген, участвуя в презентации антигенов Т-клеткам [10, 18].

Таким образом, взаимосвязь между характером инфекционного процесса, состоянием врожденного и приобретенного иммунитета и уровнем экспрессии цитокинов вызывает большой интерес. При этом в качестве экспериментальной модели для оценки выработки медиаторов воспалительного процесса в ответ на внедрение ВПЧ в организм наиболее актуальным представляется использование ДК.

Целью настоящего исследования являлось изучение цитокинового профиля ДК в ответ на стимуляцию пептидом L2 ВПЧ 16 типа in vitro. В качестве модельного пептида для стимуляции ДК нами был выбран консервативный участок минорного капсидного белка L2 ВПЧ 16 типа, содержащий с 17 по 36 аминокислотные остатки. Данный пептид согласно данным других исследователей индуцирует выработку антител с широкой перекрестной нейтрализацией гетерологичных типов ВПЧ и обеспечивает перекрестную защиту [3, 9].

Материалы и методы

Биоматериал получали путем венепункции от доноров крови в возрасте 22±5 лет, не имеющих в анамнезе признаков инфицирования ВПЧ. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли по методу Boyum A. [1]. После наслоения на фиколл-урографин проводили центрифугирование в течение 40 мин при скорости 1500 об/мин. Полученную лейковзвесь дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), разводили DMEM, после инкубации в культуральном флаконе в течение  2 часов при 37°C с 5% СО2 неприкрепившиеся клетки отмывали ФСБ, прикрепившийся слой моноцитов отделяли трипсин-версеном, отмывали ФСБ, доводили до концентрации 5×106 клеток/мл разведением в полной среде DMEM с L-глутамином и гентамицином (40 мкг/мл). Для трансформации моноцитов в ДК вносили стимуляторы роста  GM-СSF в конечной концентрацией 72 нг/мл и IL-4 – 50 нг/мл трехкратно на 1, 3 и 7 сутки культивирования, затем для стимуляции полученной культуры ДК вносили синтезированный свободный пептид L2 ВПЧ 16 типа в концентрации 50 (группа 2) и 250 нг/мл (группа 3), в качестве контроля спонтанного ответа использовали культуру ДК без стимуляции пептидом (группа 1). Исследуемые группы культур ДК оставляли для экспозиции от 1 до 3 суток.

Фенотипирование ДК проводили по наличию CD80, CD86, HLA-DR с использование проточного цитометра FACS Canto II (Becton Dickinson and Company, США).

Концентрацию про- и противовоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-a, IFN-γ, TNF-a; моноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1); фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) определяли  иммуноферментным анализом с использованием коммерческих тест-систем АО «Вектор-Бест» (Новосибирск).

Статистический анализ проводили с использованием программы StatTech v. 3.0.6 (разработчик – ООО "Статтех", Россия). Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка и критерия Колмогорова-Смирнова. Количественные показатели, имеющие нормальное распределение, описывались с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD) с 95% доверительным интервалом (95% ДИ). В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывали с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1 – Q3).

Результаты

Результаты определения уровня продукции цитокинов, спонтанного и индуцированного синтезированным пептидом белка L2 ВПЧ 16 типа в культуре ДК in vitro представлены в таблице 1.

При внесении пептида L2 ВПЧ 16 типа в сравнении со спонтанным ответом было выявлено два варианта цитокинового ответа ДК на синтезированный пептид: с увеличением концентрации цитокина (1-й вариант), без достоверно значимого изменения концентрации цитокина (2-й вариант). В первый вариант реагирования вошли МСР-1, VEGF, IL-6, IFN-γ, во второй – IL-1β, IL-4 и IL-8, IFN-α, TNF-α.

Наилучшую реактивность при воздействии пептида L2 ВПЧ 16 типа показали МСР-1 и VEGF, в 100% проб произошел выброс хемоаттрактанта, при этом уровень реагирования МСР-1 и WEGF при меньшей концентрации пептида (50 нг/мл) был выше, чем при его большей концентрации (250 нг/мл).

Повышения концентрации цитокина IL-1β в ответ на внесение пептида вне зависимости от дозы не выявлено. В ответ на стимуляцию вирусным пептидом L2 ВПЧ 16 типа ДК увеличился синтез противовоспалительного цитокина IL-10: при более низкой концентрации пептида (50 нг/мл) – в 3 раза, при более высокой (250 нг/мл) – в 1,5 раза по сравнению со спонтанным ответом.

В вариант без достоверно значимого изменения концентрации цитокинов вошли IL-4, IL-8, IFN-α и TNF-α, стимуляции их синтеза при воздействии пептида L2 ВПЧ 16 типа не происходило вне зависимости от его концентрации.

В ответ на действие пептида минорного капсидного протеина L2 ВПЧ 16 типа выявлено увеличение продукции ДК IL-6, IFN-γ.

Обсуждение

При активации иммунной защиты, как локального, так и системного характера, цитокины координируют работу иммунных клеток. Определение концентрации цитокинов, вырабатываемых ДК, позволяет оценить их функциональную активность. Сниженная индуцированная продукция цитокинов в ответ на стимуляцию может служить одним из признаков формирования иммунодефицитного состояния.

В данном исследовании реактивный ответ VEGF, привлекает особое внимание как регулятор роста опухолей и формирования метастазов, являясь одним наиболее важным индуктором ангиогенеза ассоциированного с дисплазией шейки матки высокой степени канцерогенеза и с инвазивным плоскоклеточным раком шейки матки [17].

МСР-1 известен как моноцитарный хемотаксический фактор, в большом количестве синтезирующийся макрофагами. Именно поэтому МСР-1 играет важную роль в патогенезе многих заболеваний, сопровождающихся мононуклеарной инфильтрацией тканей. МСР-1 способен привлекать в зону повреждения не только моноциты, но и Т-лимфоциты (СD4+, СD8+) и базофилы, соответственно от активности этого фактора зависит тип реагирования и количество рекрутированных в очаг воспаления клеток [7].

В отношении МСР-1 по данным нашего эксперимента, показано активное реагирование ДК на пептид вируса, создающее предпосылки для активизации миграции клеток в очаг поражения.

В данном эксперименте мы не получили повышение концентрации цитокина IL-1β в ответ на внесение 50 нг/мл L2 ВПЧ 16 и 250 нг/мл L2 ВПЧ 16. Таким образом, не был выявлено дозозависимого эффекта при воздействи пептида L2ПЧ 16 типа на продукцию ДК антиапоптотического цитокина IL-1β, который многие исследователи связывают с иммуносупрессией иммунного ответа Т-регулярными лимфоцитами [10].

Выявленные нами совокупные изменения продукции IL-10 в ответ на стимуляцию ДК пептидом L2 in vitro, вероятно, позволяют вирусу в организме поляризовать иммунный ответ, формировать очаг воспаления с низкой степенью активности и обеспечивать длительную персистенцию вируса [13].

В ответ на стимуляцию пептидом L2 ВПЧ 16 концентрациями 50-250 нг/мл реакции со стороны цитокинов: IL-4, IL-8 не наблюдалось, также не был выявлен дозозависимый ответ вирусной нагрузки, которому отводят ведущую роль в трансформации противовирусного иммунитета.

В нашем эксперименте цитокины IFN-α и TNF-α, способствующие пролиферации пораженных клеток цервикса, не показали достоверно значимого увеличения концентраций в ответ на стимуляцию пептидом L2 ВПЧ 16 в дозе 50-250 нг/мл [16].

В ответ на действие минорного капсидного протеина L2 мы получили увеличении продукции ДК IFN-γ, который обуславливает активирующее действие на клетки иммунной системы. [15] Такие разнонаправленные изменения в интерфероновом звене сказываются на качестве противовирусного ответа. Благодаря свойствам модифицировать интерфероновый ответ ВПЧ способен к длительной персистенции в организме хозяина с последующей онкогенной трансформацией.

Вариант реагирования зависит от концентрации вирусного пептида L2 ВПЧ 16 типа. Выявлена прямая и обратная зависимость от концентрации вирусного пептида. Дозозависимый ответ показывает ведущую роль вирусной нагрузки в трансформации противовирусного иммунитета.

Выявленный дисбаланс соотношения про- и противовоспалительных цитокинов в ответ на внесение пептида L2 ВПЧ 16 в культуру ДК приводит к депрессии воспалительного ответа, формированию иммунодефицитного состояния и длительной персистенции вируса в организме.

Заключение

Полученные результаты подтверждают способность ВПЧ уклоняться от противовирусной иммунной защиты путем изменения синтеза ряда цитокинов. Необходимо проводить дальнейшие исследования для сравнительного изучения воздействия пептидов вируса папилломы человека на цитокиновый профиль у здоровых и инфицированных вирусом папилломы человека лиц на разных стадиях инфекционного процесса, что может быть использовано в дальнейшем для разработки методов ранней диагностики, а также при проведении иммунокорректирующей терапии у пациентов.

(Работа выполнена в рамках научно-исследовательской работы «Изучение эффективности клеточного иммунного ответа у ВИЧ - позитивных лиц, инфицированных вирусом папилломы человека» (рег. номер в ЕГИСУ НИОКТР 122040600157-0) отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора).

×

About the authors

Ivan Vladimirovich Vyalykh

Federal Budgetary Institution of Science «Federal Scientific Research Institute of Viral Infections «Virome» Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Author for correspondence.
Email: vyalykh_iv@niivirom.ru
ORCID iD: 0000-0002-3123-8359
SPIN-code: 9107-4118
Scopus Author ID: 57195531035
ResearcherId: H-6638-2016

PhD, Leading Researcher, Laboratory of Vector-Borne Viral Infections and Tick-Borne Encephalitis

Russian Federation, 620030, Ekaterinburg, Letnyaya st., 23

Ksenia Elbertovna Boeva

Federal Budgetary Institution of Science «Federal Scientific Research Institute of Viral Infections «Virome» Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Email: boeva_ke@niivirom.ru
ORCID iD: 0000-0001-5467-0702
SPIN-code: 9153-5103

Junior Researcher, the Laboratory of Vector-borne Viral Infections and Tick-borne Encephalitis

Russian Federation, 620030, Ekaterinburg, Letnyaya st., 23

Galina Vladimirovna Malyschkina

Federal Budgetary Institution of Science «Federal Scientific Research Institute of Viral Infections «Virome» Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Email: malyschkina_gv@niivirom.ru
ORCID iD: 0000-0002-1259-8850
SPIN-code: 4161-0999

Junior Researcher, the Laboratory of Vector-borne Viral Infections and Tick-borne Encephalitis

Russian Federation, 620030, Ekaterinburg, Letnyaya st., 23

References

  1. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 1968, Vol. 12. pp. 77- 89.
  2. Brockmann L., Soukou S., Steglich B., Czarnewski P. Molecular and functional heterogeneity of IL-10-producing CD4+ T cells. Nature Communications, 2018, Vol. 21, no. 9, pp. 54 - 57.
  3. Bryant C. et al. A CD2 high-expressing stress-resistant human plasmacytoid dendritic-cell subset. Immunology and Cell Biology, 2016, Vol. 94, pp. 447 - 457.
  4. Garg A.D., Vara Perez. M., Schaaf M., Agostinis P., Zitvogel L., Kroemer G., Galluzzi L. Trial watch: Dendritic cell-based anticancer immunotherapy. Europe PMC, 2017, Vol. 6, no. 7.
  5. Gutiérrez-Hoya A, Soto-Cruz I. NK Cell Regulation in Cervical Cancer and Strategies for Immunotherapy. Cells, 2021, Vol.10, no.11.
  6. Hong S., Laimonis A. Laimins. Manipulation of the innate immune response by human papillomaviruses. Virus Research, 2017, Vol. 231, pp. 1-176.
  7. Kleine-Lowinski K, Rheinwald J.G, Fichorova R.N, Anderson D.J, Basile J, Münger K, Daly K.M, Rösl F, Rollins B.J. Selective suppression of monocyte chemoattractant protein-1 expression by human papillomavirus E6 and E7 oncoproteins in human cervical epithelial and epidermal cells. International Journal of Cancer, 2003, Vol. 107, no.3, pp. 407 – 415.
  8. Lefkowitz E. J, Dempsey D. M, Hendrickson R. C, Orton R. J, Siddel S. Gl, Smith D. B. Virus taxonomy: the database of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). Nucleic Acids Research, 2018, рр. 708–717.
  9. Mahendra1 I.N.B., Prayudi1 P.K.A., Putra Dwija I.B.N., Suwiyoga K. HPV16-E6/E7 Oncogene Mutation and p53 Expression among Indonesian women with cervical Cancer. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2022, Vol. 23, no. 8, pp. 2705-2711.
  10. Nakayama T., Kashiwagi Y., Kawashima H. Long-term regulation of local cytokine production following immunization in mice. Medical Microbiology and Immunology, 2018, Vol. 62, no. 2, pp. 124-131.
  11. Ntanasis-Stathopoulos I., Kyriazoglou A., Liontos M., Dimopoulos M.A, Gavriatopoulou M. Current trends in the management and prevention of human papillomavirus (HPV) infection. JBUON, 2020, Vol. 25, no. 3, pp . 1281-1285.
  12. Rojas-Sepúlveda D.A., et al., Tumor lysate loaded dendritic cells induce a Tcell specific antitumor response against gallbladder cancer. Journal of Immunology, 2017, Vol. 198, no. 79, pp. 18–79.
  13. Sadri Nahand J, Moghoofei M, Salmaninejad A, Bahmanpour Z, Karimzadeh M, Nasiri M, Mirzaei H.R, Pourhanifeh M.H, Bokharaei-Salim F, Mirzaei H, Hamblin M.R. Pathogenic role of exosomes and microRNAs in HPV-mediated inflammation and cervical cancer: A review. International Journal of Cancer, 2020, Vol. 146, no. 2, pp. 305-350.
  14. Skelin J., Sabol I., Vjekoslav T. Do or Die: HPV E5, E6 and E7 in Cell Death Evasion. Pathogens, 2022, Vol. 1, no. 9, p. 1027.
  15. Song S-H., Kwan Lee J., Seok O-S., Saw H-S. The relationship between cytokines and HPV-16, HPV-16 E6, E7, and high-risk HPV viral load in the uterine cervix. Gynecologic Oncology, 2007, Vol. 104, no. 3, p. 732.
  16. Xiao Yang, Yanxiang Cheng, Chunsbeng Li. The role of TLRs in cervical cancer with HPV infection: a review. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2017, Vol. 2, no. 17055, p. 1.
  17. Yuan Y, Min S-J, Xu D-Q, Shen Y, Yan H-Y, Wang Y, Wang W, Tan Y-J. Expressions of VEGF and miR-21 in tumor tissues of cervical cancer patients with HPV infection and their relationships with prognosis. European Review for Medical and Pharmacological Science, 2018, Vol. 22, no. 19, pp. 6274-6279.
  18. Zhou B, Lawrence T, Liang Y. The Role of Plasmacytoid Dendritic Cells in Cancers. Frontiers in immunology, 2021, Vol. 12, no.749190.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) Vyalykh I.V., Boeva K.E., Malyschkina G.V.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies