Effects of peptide L2 of human papillomavirus type 16 on the cytokine profile of dendritic cells in vitro

Texto integral

Введение

Инфицирование вирусом папилломы человека (ВПЧ) является одним из факторов канцерогенеза. У большинства людей при заражении ВПЧ защитные противовирусные механизмы оказываются эффективными и происходит элиминация возбудителя из организма, только часть инфицированных приобретают хроническую форму папилломавирусной инфекции, у некоторых развиваются онкологические заболевания. Первыми ВПЧ поражает клетки кожи и слизистых оболочек, при проникновении вируса происходит запуск воспалительных иммунных реакций, в которых принимают участие интерлейкины, хемокины, факторы роста, интерфероны, а также продуцирующие их клетки (кератиноциты, макрофаги, клетки Лангерганса, фибробласты, эндотелиоциты, лимфоциты) при участии рецепторного аппарата [1]. От состояния иммунной системы индивидуума зависит как инфицирование ВПЧ, так и развитие определённой клинической формы инфекции [2].

Папилломавирусы (ПВ) в процессе своей эволюции приобрели различные биологические особенности, которые необходимы для их облигатной эпителиотропности. Представители данной группы патогенов являются онкогенными безоболочечными вирусами с двухцепочечной ДНК. При их репликации происходит синтез ранних (E) и поздних (L) белков. При микротравмах осуществляется первичное инфицирование базальных эпителиальных клеток, в которых вирус сохраняется в низких титрах, при этом репликация вируса связана с дифференцировкой многослойного эпителия. Синтез белков капсида L1 и L2, а также инкапсуляция генома вируса происходит исключительно в верхних слоях эпителия, затем вирионы отделяются вместе с отслоившимися эпителиальными клетками. ВПЧ локально персистируют в очаге инфекции при отсутствии системной виремии, что препятствует доступу антигенпрезентирующих клеток и обеспечивает нелитический цикл репликации вируса [3].

ВПЧ при проникновении в организм активирует защитные функции врождённого иммунитета. С помощью толл-подобных рецепторов (TLR4, TLR7, TLR8, TLR9), расположенных на клетках Лангерганса, макрофагах и других иммунных клетках, происходит распознавание чужеродных нуклеиновых кислот. Как только инфекция ВПЧ выходит из-под контроля врождённого иммунитета, адаптивный иммунитет становится ведущим при уничтожении инфицированных ВПЧ эпителиальных клеток шейки матки посредством системного иммунного ответа, осуществляемого с участием дендритных клеток (ДК) в регионарных лимфоидных органах, или посредством местного иммунного ответа. Обход ВПЧ иммунной системы обусловлен локальной иммуносупрессией, а также отсутствием цитолиза и виремии, помимо этого ВПЧ способен тормозить активацию и миграцию клеток Лангерганса [4].

Цитокины выполняют важные физиологические функции, в том числе участвуют в ответе на воздействие патогена, относятся к классу полипептидных медиаторов клеток иммунной системы, посредством которых происходят межклеточные взаимодействия [5]. В связи с этим уделяется большое внимание изучению роли цитокинов в реализации регуляторных иммунных процессов.

Интерлейкины участвуют во всех этапах системного и локального иммунного ответа: при распознавании антигенов; активации антигенпрезентирующих клеток; миграции иммунокомпетентных клеток к месту воспаления; выработке различных клонов цитотоксических клеток [6].

Показано увеличение провоспалительных цитокинов IL-8, снижение противовоспалительного IL-10 при исследовании локального иммунного ответа на инфицирование ВПЧ высокого канцерогенного риска в цервикальной слизи у женщин и эякуляте у мужчин. В работах отмечалась низкая концентрация антиапоптотического IL-1β и TNF-α, значение IFN-γ у инфицированных ВПЧ пациентов превышало нормальный уровень, а содержание IFN-α практически не отличалось от контрольной группы. Таким образом, разнонаправленные изменения концентрации цитокинов и интерферонов способствуют длительной персистенции ВПЧ, снижая возможность элиминации вируса, замедляя процесс апоптоза, что приводит к развитию интраэпителиальных поражений [7].

Наличие гибких свойств ДК и прямое участие в регуляции воспаления характеризуют их как экспрессивные регуляторы эффективности клеточного иммунитета. ДК являются источниками цитокинов, выступающих важными стимуляторами первичного иммунного ответа [8], и ключевым звеном в иммунном ответе на патоген, участвуя в презентации антигенов Т-клеткам [9, 10].

Таким образом, взаимосвязь между характером инфекционного процесса, состоянием врождённого и приобретённого иммунитета и уровнем экспрессии цитокинов вызывает большой интерес. При этом в качестве экспериментальной модели для оценки выработки медиаторов воспалительного процесса в ответ на внедрение ВПЧ в организм наиболее актуальным представляется использование ДК.

Цель исследования — изучение цитокинового профиля ДК в ответ на стимуляцию пептидом L2 ВПЧ 16-го типа in vitro. В качестве модельного пептида для стимуляции ДК нами был выбран консервативный участок минорного капсидного белка L2 ВПЧ 16-го типа, содержащий с 17-го по 36-й аминокислотные остатки. Данный пептид, согласно данным других исследователей, индуцирует выработку антител с широкой перекрёстной нейтрализацией гетерологичных типов ВПЧ и обеспечивает перекрёстную защиту [11, 12].

Материалы и методы

Образцы крови для получения ДК получали от доноров крови в возрасте 22±5 лет, не имеющих в анамнезе признаков инфицирования ВПЧ. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли по методу A. Boyum [13]. Кровь наслаивали на фиколл-урографин, центрифугировали в течение 40 мин при скорости 1500 об/мин. Полученную взвесь мононуклеарных клеток крови отмывали двукратно фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ), ресуспендировали DMEM, переносили в культуральные флаконы, инкубировали при 37 °C в течение 2 ч в СО₂-инкубаторе, затем отмывали ФСБ неприкрепившиеся клетки, слой моноцитов отделяли с использованием раствора трипсина–версена, отмывали ФСБ, доводили до концентрации 5×10⁶ кл/мл путём разведения в полной среде DMEM с L-глутамином и гентамицином (40 мкг/мл). Для трансформации моноцитов в ДК вносили стимуляторы роста IL-4 в концентрации 50 нг/мл и GM-СSF в концентрации 72 нг/мл трёхкратно на 1, 3 и 7-е сут культивирования. Фенотипирование ДК проводили по наличию CD80, CD86, HLA-DR с использование проточного цитометра FACS Canto II (Becton Dickinson and Company, США).

В качестве контрольной группы использовали культуру ДК без стимуляции пептидом (группа 1). В качестве экспериментальных групп — культуры ДК, в которые вносили синтезированный свободный пептид L2 ВПЧ 16-го типа в концентрации 50 нг/м (группа 2) и 250 нг/мл (группа 3). Исследуемые группы культур ДК оставляли для экспозиции от 1 до 3 сут.

Количество про- и противовоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-α, IFN-γ, TNF-α), моноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в контрольных и экспериментальных группах культур ДК определяли методом иммуноферментного анализа с применением коммерческих тест-систем (АО «Вектор-Бест», г. Новосибирск).

Статистический анализ

Описательную статистику для непрерывных переменных, при условии соответствия нормальному распределению, представляли в виде среднего арифметического с указанием 95% доверительного интервала (95% confidence interval) — 95% ДИ (CI) (M [нижняя граница — верхняя граница 95% ДИ]); для показателей (выборок), распределение которых не соответствует нормальному, центральные тенденции и меры разброса выражали в виде медианы и интерквартильного размаха (Me [Q₁–Q₃]).

Для проверки условия соответствия выборок нормальному распределению применяли критерий согласия Шапиро–Уилка.

Статистическая обработка результатов проведена с использованием программы StatTech, v. 3.0.6 (ООО «Статтех», Россия).

Все аспекты работы заслушаны и одобрены на заседании локального этического комитета ЕНИИВИ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (протокол ЛЭК № 3 от 24.06.2022).

Результаты

Результаты определения уровня продукции цитокинов, спонтанного и индуцированного синтезированным пептидом белка L2 ВПЧ 16-го типа в культуре ДК in vitro, представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Продукция цитокинов в культуре дендритных клеток in vitro

Table 1. Cytokine production in dendritic cell culture in vitro

Цитокины, нг/мл Cytokines (ng/ml)	Спонтанный ответ (группа 1, n=46) Spontaneous response (group 1, n=46)		Ответ, стимулированный пептидом L2 вируса папилломы человека 16-го типа Response stimulated by peptide L2 of the human papillomavirus type 16
			50 нг/мл (группа 2, n=46) 50 ng/ml (group 2, n=46)		250 нг/мл (группа 3, n=46) 250 ng/ml (group 3, n=46)
	M/Me	95% ДИ (CI) / Q1–Q3	M/Me	95% ДИ (CI) / Q1–Q3	M/Me	95% ДИ (CI) / Q1–Q3
IL-1β	10	[6–13]	10	[7–13]	10	[9–17]
IL-4	162	[155–169]	164	[163–165]	164	[162–166]
IL-6	5	[4–16]	11	[7–15]	16	[6–25]
IL-8	255	[249–261]	257	[253–261]	258	[253–264]
IL-10	8	[4–11]	27	[22–33]	13	[11–16]
MCP-1	1245	[1062–1428]	2211	[1987–3088]	2263	[1690–2836]
IFN-α	5	[0–15]	5	[0–15]	6	[0–17]
IFN-γ	9	[8–10]	12	[10–14]	13	[12–14]
TNF-α	1	[1–2]	1	[1–2]	2	[1–4]
VEGF	4	[3–7]	24	[11–203]	18	[5–153]

 

После внесении пептида L2 ВПЧ 16-го типа в сравнении со спонтанным ответом в контрольной группе регистрировали два варианта цитокинового ответа ДК: 1) с увеличением концентрации цитокина (1-й вариант); 2) без достоверно значимого изменения концентрации цитокина (2-й вариант). В 1-й вариант реагирования вошли IL-10, МСР-1, VEGF, IL-6, IFN-γ, во 2-й вариант — IL-1β, IL-4 и IL-8, IFN-α, TNF-α.

Наибольшую реактивность на воздействие пептида L2 ВПЧ 16-го типа показали МСР-1 и VEGF, в 100% проб произошёл рост концентрации хемоаттрактанта, при этом уровень реагирования МСР-1 и VEGF при меньшей концентрации пептида (50 нг/мл) был выше, чем при его большей концентрации (250 нг/мл).

Повышения концентрации цитокина IL-1β в ответ на внесение пептида вне зависимости от дозы не выявлено. В ответ на стимуляцию вирусным пептидом L2 ВПЧ 16-го типа ДК увеличился синтез IL-10: при этом при более низкой концентрации пептида (50 нг/мл) произошёл рост в 3 раза, а при более высокой концентрации (250 нг/мл) — только в 1,5 раза в сравнении со спонтанным ответом.

В вариант без достоверно значимого изменения концентрации цитокинов вошли IL-4, IL-8, IFN-α и TNF-α, стимуляции их синтеза при воздействии пептида L2 ВПЧ 16-го типа не происходило вне зависимости от его концентрации.

В ответ на действие пептида минорного капсидного протеина L2 ВПЧ 16-го типа выявлено увеличение продукции ДК IL-6, IFN-γ.

Обсуждение

Поскольку цитокины координируют работу иммунных клеток при активации иммунного ответа, определение концентрации цитокинов, вырабатываемых ДК, позволяет оценить их функциональную активность. Пониженный синтез цитокинов в ответ на стимуляцию антигенами может являться одним из признаков развития иммунодефицитного состояния.

Подтверждённая в опыте стимуляция продукции IL-6 (провоспалительный цитокин, медиатор межклеточного взаимодействия Т- и В-лимфоцитов) и IL-10 (противовоспалительный цитокин) в ответ на воздействие на ДК пептида L2 ВПЧ 16-го типа in vitro, вероятно, способствует поляризации иммунного ответа организма, приводит к низкой степени активности очага воспаления и длительной персистенции вируса [14].

МСР-1 (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор) в большом количестве синтезируется макрофагами, являясь наиболее мощным фактором хемотаксиса моноцитов, Т-клеток памяти (СD4+, СD8+), базофилов и ДК к фокусам воспаления в организме, в связи с чем играет важную роль в патогенезе многих заболеваний, сопровождающихся мононуклеарной инфильтрацией тканей [15]. В нашем эксперименте выявлено активное реагирование ДК на пептид вируса с активацией синтеза МСР-1, что создает предпосылки для активизации миграции клеток в очаг поражения.

В проведённом нами исследовании цитокины IFN-α и TNF-α, способствующие пролиферации поражённых клеток цервикса, не показали достоверно значимого увеличения концентраций в ответ на стимуляцию пептидом L2 ВПЧ 16-го типа [16]. При этом получили увеличение продукции IFN-γ, который обусловливает активирующее действие на клетки иммунной системы [17]. Данные изменения в интерфероновом звене воздействуют на качество противовирусного иммунного ответа. Модифицированный интерфероновый ответ на ВПЧ также может способствовать длительной персистенции вируса в организме хозяина с последующей онкогенной трансформацией.

Выявленный реактивный ответ VEGF привлекает особое внимание в качестве регулятора роста опухолей и формирования метастазов, являясь наиболее важным индуктором ангиогенеза, ассоциированного с дисплазией шейки матки высокой степени канцерогенеза и с инвазивным плоскоклеточным раком шейки матки [18].

Установленный дисбаланс соотношения про- и противовоспалительных цитокинов в ответ на внесение пептида L2 ВПЧ 16-го типа в культуру ДК способствует депрессии воспалительного ответа, формированию иммунодефицитного состояния организма и длительной персистенции вируса в нём.

Заключение

Полученные результаты подтверждают способность ВПЧ к уклонению от противовирусного иммунного ответа организма путём воздействия на синтез ряда цитокинов. Необходимо проводить дальнейшие исследования для сравнительного изучения воздействия пептидов ВПЧ на цитокиновый профиль у здоровых и инфицированных ВПЧ лиц на разных стадиях инфекционного процесса, что может быть использовано в дальнейшем для разработки методов ранней диагностики, а также при проведении иммунокорректирующей терапии у пациентов.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках научно-исследовательской работы «Изучение эффективности клеточного иммунного ответа у ВИЧ-позитивных лиц, инфицированных вирусом папилломы человека» (рег. номер в ЕГИСУ НИОКТР 122040600157-0) отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: К.Э. Боева — проведение исследований, сбор данных, написание черновика рукописи; Г.В. Малышкина — проведение исследований; И.В. Вялых — разработка концепции работы, написание и редактирование текста рукописи.

Additional information

Funding source. This work was performed within the research project “Study of the effectiveness of cellular immune response in HIV-positive individuals infected with human papillomavirus” (registration in Unified State Information System for Accounting of Scientific Research, Experimental and Technological Studies No. 122040600157-0) of the sectoral research program of Rospotrebnadzor (Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing).

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work). K.A. Boeva — laboratory research, data collection, writing the draft manuscript; G.V. Malyshkina — laboratory research; I.V. Vyalykh — development of the concept of the work, writing and editing the text of the manuscript.

Sobre autores

Ksenia Boeva

Federal Scientific Research Institute of Viral Infections “Virome”

Email: boeva_ke@niivirom.ru
ORCID ID: 0000-0001-5467-0702
Código SPIN: 9153-5103

Junior Researcher

Rússia, Yekaterinburg

Galina Malyshkina

Federal Scientific Research Institute of Viral Infections “Virome”

Email: malyshkina_gv@niivirom.ru
ORCID ID: 0000-0002-1259-8850
Código SPIN: 4161-0999

Junior Researcher

Rússia, Yekaterinburg

Ivan Vyalykh

Federal Scientific Research Institute of Viral Infections “Virome”

Autor responsável pela correspondência
Email: vyalykh_iv@niivirom.ru
ORCID ID: 0000-0002-3123-8359
Código SPIN: 9107-4118

Cand. Sci. (Veterinary), Leading Researcher

Rússia, Yekaterinburg

Bibliografia

Arquivos suplementares