Characteristics of innate immunity cells after diseases caused by the SARS-COV-2 virus

N. G. Plekhova; Плехова Н. Г.; E. V. Prosekova; Просекова Е. В.; T. A. Sitdikova; Ситдикова Т. А.; A. A. Dubiy; Дубий А. А.; A. O. Mikhailov; Михайлов А. О.

doi:10.17816/CI2023231-6

Characteristics of innate immunity cells after diseases caused by the SARS-COV-2 virus

Authors: Plekhova N.G.¹, Prosekova E.V.¹, Sitdikova T.A.¹, Dubiy A.A.¹, Mikhailov A.O.¹
Affiliations:
1. Pacific State Medical University
Issue: Vol 20, No 1 (2023)
Pages: 41-46
Section: Original Study Articles
URL: https://cijournal.ru/1684-7849/article/view/623778
DOI: https://doi.org/10.17816/CI2023231-6
ID: 623778

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Hyperinflammation and dysfunction of the immune response during COVID-19 infection develops due to the reaction of innate immune cells to the introduction of the SARS-CoV-2 virus. The expression of receptors on these cells reflects the degree of their activation and makes it possible to assess the intensity of inflammation. The purpose of this study were to study the structural and functional features of innate immunity cells in patients. The specific gravity and absolute content of neutrophils (CD11b⁺, CD16⁺, CD18⁺) and monocytes (CD14⁺CD16^–, CD14^–CD16⁺, CD11b⁺, CD18⁺) in the peripheral blood of patients were determined. The contingent of the study included 60 people, of which: 47 had had a coronavirus infection COVID-19 (confirmed by PCR) in the 12 weeks preceding the study, and 13 had no history of it. In the peripheral blood of people who had COVID-19, compared with those who had not been ill, a significantly lower number of monocytes of the classical (CD14^–CD16⁺) and, on the contrary, a greater number of non-classical (CD14⁺CD16^–) cell populations were determined (p<0.05). Also in these individuals, a high proportion of monocytes carrying the adhesion receptors CD11b and CD18 (p<0.01) and a high content of neutrophils expressing the adhesion receptor CD11b⁺ and CD16⁺ (p<0.05) was noted. Thus, the results of a study of the expression of various types of receptors on monocytes and neutrophils illustrated the long-term preservation of aberrant structural and functional characteristics of innate immunity cells in individuals who underwent COVID-19.

Keywords

COVID-19, SARS-CoV-2 virus, innate immune cells, monocytes, neutrophils

Full Text

Введение

Эволюция инфекционного процесса COVID-19, вызванного SARS-CoV-2, вариабельна, инициируется дисрегуляцией иммунных процессов, негативным влиянием вируса на клетки врожденного иммунитета. В последующем эти процессы инициируют развитие гипервоспаления, нарушение деятельности респираторной и сердечно-сосудистой систем, что нередко приводит к возникновению жизнеугрожающих состояний и смерти пациента [1, 4, 7, 10, 12, 15]. Исход болезни с первых дней заражения зависит от баланса между кумулятивной дозой вирусного воздействия и степенью реакции и скоординированности иммунного ответа [3, 6, 9, 16, 21].

Моноциты и гранулоциты опосредуют начальные иммунные реакции на патогены, создавая в очаге инвазии вируса воспалительную среду, ограничивающую его репликацию и создающую условия для его элиминации. Постулируется, что гипервоспаление и дисфункция иммунного ответа при инфекции COVID-19 развивается вследствие высокой реакции клеток врожденного иммунитета на внедрение вируса SARS-CoV-2 [6, 14, 15, 21]. В условиях негативного влияния SARS-CoV-2 на систему врожденного иммунитета этот процесс приобретает черты избыточной реакции клеток. Величина и комбинация специфических медиаторов в воспалительной среде управляет активацией нейтрофилов и моноцитов, что определяет степень и тип инициируемых ими эффекторных программ. Вирусная инфекция COVID-19 сопровождается массивным образованием цитокинов этими клетками, которое приводит к продолжительному присутствию сигналов активации нейтрофилов и моноцитов с чрезмерным эффекторным ответом, способствуя утяжелению заболевания [19, 20]. В ответ на внедрение вируса при гипервоспалении дисбаланс синтеза цитокинов определяет хемотаксис и значительное накопление активированных нейтрофилов и моноцитов в очаге, состояние которых иллюстрируется экспрессией поверхностных рецепторов [14, 16]. Имеются данные, что повышение абсолютного числа нейтрофилов на фоне снижения количества лимфоцитов с увеличением индекса соотношения этих клеток являются маркерами более тяжелого течения заболевания [2]. Исследования пациентов с COVID-19 выявили взаимосвязь тяжести заболевания, наличия постковидного синдрома с аберрантным функционированием клеток врожденного иммунитета и дисрегуляцией цитокиновой сети [9]. В ряде исследований зафиксировано, что аберрантное функционирование системы врожденного иммунитета при COVID-19 сохраняется в течение нескольких месяцев после болезни и предрасполагает к реинфекции с тяжелым течением [11, 13, 16, 18]. Актуальность изучения влияния SARS-CoV-2 на функционирование факторов врожденного иммунитета обосновала цель и задачи данного исследования с проведением структурно-функциональной характеристики клеток врожденного иммунитета у пациентов, перенесших коронавирусную инфекцию, вызванную вирусом SARS-CoV-2. В исследовании определяли удельный вес и абсолютное содержание нейтрофилов (CD11b⁺, CD16⁺, CD18⁺) и моноцитов (CD14⁺CD16^–, CD14^–CD16⁺, CD11b⁺, CD18⁺) в периферической крови у пациентов, перенесших коронавирусную инфекцию COVID-19.

Материалы и методы

Контингент исследования составили 60 человек в возрасте от 23 до 60 лет (средний возраст 43,80±8,60), включая 47 человек, перенесших коронавирусную инфекцию (подтвержденную методом ПЦР) среднетяжелого или тяжелого течения с разной степенью поражения легочной ткани, и 13 человек, не болевших коронавирусной инфекцией, составили группу сравнения. Группы наблюдения были сопоставимы по полу и возрасту. Критерии исключения: ОРВИ, обострения хронических заболеваний дыхательной системы; применение иммунотропных препаратов, в течение предшествующих исследованию 6 месяцев.

Клинический анализ крови проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Mindray BC 3000 PLus (Mindray, Китай), определяющим относительное и абсолютное содержание лейкоцитов, нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, лимфоцитов, моноцитов. Для фенотипирования клеток использовали моноклональные антитела мыши, специфичные для человека, к рецепторам CD11b, CD14, CD16 и CD18, конъюгированные с FITС, фикоэритрином (РЕ), PE-Vio, PerCP, аллофикоцианином (APC) (Miltenyi Biotec GmbH, Германия) согласно инструкциям производителя. Для оценки степени экспрессии рецепторов анализ проводили на автоматическом цитофлуориметре MACSQuant® Analyzer 10 (Miltenyi Biotech, Германия). Для оценки содержания CD14⁺CD16^–, CD14^–CD16⁺, CD11b⁺, CD18⁺ клеток использовали двухпараметровые и однопараметровые дот-плоты с гейтированием в суммарной моноцитарной популяции и для определения количества CD16⁺, CD11b⁺, CD18⁺ однопараметровые дот-плоты с гейтированием в популяции нейтрофилов. Для исключения неспецифического связывания моноклональных антител проводился флуорохром-коньюгированный изотипический контроль. Детекция полученных результатов выполнялась с использованием программного обеспечения MACSQuantify™ Software v.2.5 (Miltenyi Biotec GmbH, Германия) и Kaluza (Beckman Dickinson, США). Результаты представлялись в виде абсолютного количества каждой субпопуляции клеток в единице объема (кл×10⁹/л) и относительного количества позитивных клеток (%).

Полученные данные обрабатывали с помощью пакета программ Microsoft Exсel 2018 (Microsoft Inc., США). Проверка на нормальное распределение количественных показателей выборок проводилась по критерию Шапиро-Уилка. При обработке данных использовались методы непараметрической статистики при коэффициенте вариации больше 30 %. Дескриптивные статистики представлены как Me (LQ-UQ), где Me – медиана, LQ – нижний и UQ – верхний квартили. Оценку различий средних значений в попарно несвязанных выборках проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. При статистическом анализе учитывался критический уровень значимости р < 0,05.

Результаты и обсуждение

После перенесенной инфекции COVID-19 в крови пациентов наблюдалось долговременное изменение количественных показателей и фенотипического портрета иммунокомпетентных клеток. Данные клинического анализа показывают, что абсолютное число лейкоцитов в острый период заболевания COVID-19 (9,09±0,3×10⁹ кл/л) сопоставимо с таковым для выздоровевших лиц (9,14±0,2×10⁹ кл/л; t = 0,1; р > 0,05). Не обнаружено значимых различий между абсолютным содержанием лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов. Количество лимфоцитов для не болевших COVID-19 лиц составило 2,37±0,1×10⁹ кл/л и для переболевших 2,39±0,09×10⁹ кл/л (t = 0,1; при р > 0,05), моноцитов – 0,56±0,03×10⁹ кл/л и 0,56±0,03×10⁹кл/л (t = 0; при р > 0,05), нейтрофилов –5,65±0,2×10⁹ кл/л и 5,89 ± 0,26×10⁹ кл/л соответственно (t = 0,6; при р > 0,05). Показатели базофилов и эозинофилов в крови лиц исследуемых групп значимо различались, их число в крови обследуемых, перенесших COVID-19 (0,11±0,01×10⁹ кл/л и 0,42 ± 0,05×10⁹ кл/л), превышало значения для не болевших лиц (0,03 ± 0,01×10⁹/л и 0,21±0,03×10⁹/л, р < 0,05). В структуре лейкоцитограммы наибольший удельный вес среди ядросодержащих клеток имели нейтрофильные гранулоциты. У переболевших COVID-19 процент нейтрофилов составил 61,45±1,32 %, у не болевших – 64,39±2,37 %. Значимых отличий в структуре лейкоцитограммы между показателями в группах наблюдения не обнаружено (р > 0,05).

Несмотря на практически полную идентичность показателей лейкоцитограммы у пациентов в исследуемых группах, при изучении структурно-функциональных характеристик моноцитов и нейтрофилов были выявлены достоверные различия. В процессе дифференцировки миеломоноциты, созревающие в моноциты/макрофаги и гранулоциты, экспрессируют несколько кластеров дифференцировки, из которых CD14 является маркером зрелых клеток. Выделяют две субпопуляции моноцитов: классические CD14⁺CD16^– и неклассические CD14^+dimCD16⁺, различающиеся функционально [21]. В периферической крови лиц, не болевших COVID-19, доля классической популяции моноцитов (CD14⁺CD16^–) составила 95,84±1,5 %, тогда как у лиц, имеющих в анамнезе это заболевание, значимо снижалось 90,87±2,32 % (р < 0,05). Абсолютное содержание CD14⁺CD16^– моноцитов составило 0,46±0,12×10⁹ кл/л и 0,6±0,12×10⁹ кл/л соответственно (рис. 1А). Экспрессия низкоаффинного рецептора для Fc-фрагмента иммуноглобулинов G (CD16) необходима для полноценной антитело-зависимой клеточной цитотоксичности моноцитов человека [22]. С помощью CD16 моноциты в присутствии антител способны удалять клетки, инфицированные вирусом гепатита B, а также могут проявлять цитотоксичность в отношении некоторых пораженных вирусом клеток и без антител. Своевременное приобретение иммунорегуляторного фенотипа миелоидными клетками, в частности экспрессия этого рецептора, может способствовать выздоровлению при тяжелой системной инфекции SARS-CoV-2 [21]. Нами установлено достоверное повышение абсолютного (p < 0,01) и относительного (p < 0,01) числа моноцитов неклассической субпопуляции (CD14^–CD16⁺) у лиц, болевших COVID-19, по сравнению с не болевшими (рис. 1Б). Показатели CD14^–CD16⁺ составили 14,25±3,43 % и 6,22±2,84 % при абсолютном содержании 0,08±0,03×10⁹ кл/л и 0,04±0,01×10⁹ кл/л соответственно. Рецептор интегрин альфа-M/бета-2 (αMβ2, MAC-1, CD11b) играет важную роль при взаимодействии моноцитов, макрофагов и гранулоцитов и опосредует поглощение ими частиц, связанных с фрагментом iC3b 3-го компонента комплемента. Кроме этого, он способен взаимодействовать с пептидами P1 и P2 гамма-цепи фибриногена. Другой рецептор семейства интегринов альфа-L/бета-2 (CD18) опосредует связь с молекулами клеточной адгезии (ICAM1, ICAM2, ICAM3 и ICAM4), а также, как и CD11b, принимает участие в распознавании пептидов P1 и P2 гамма-цепи фибриногена и фактора X. Более высокий удельный вес клеток, несущих интегрины альфа-M/бета-2 (CD11b) и альфа-L/бета-2 (CD18), определен на моноцитах лиц, перенесших инфекцию COVID-19 (67,91±10,59 % и 68,47±5,87 %, p < 0,01, рис. 1В, Г). Различия между абсолютным количеством CD11b⁺ и CD18⁺ моноцитов крови у обследуемых не выявлено (p > 0,05). В целом наши результаты показывают изменение иммунорегуляторного профиля моноцитов у пациентов после перенесенного заболевания COVID-19, а именно эволюцию дифференцировки этих клеток в сторону увеличения неклассической CD14-CD16⁺ M2 субпопуляции, что указывает на их готовность к выполнению цитоксической функции.

Рис. 1. Фенотипическая характеристика моноцитов крови обследованных лиц переболевших (1-я группа) и неболевших COVID-19 (2-я группа), абсолютное количество CD14⁺CD16^–(А), CD14^–CD16⁺ (Б) и экспрессирующих рецепторы адгезии CD11b⁺ (В) и CD18⁺ (Г) субпопуляций клеток

Примечание: ** различия между показателями достоверны при р < 0,01.

Результаты исследования маркеров адгезии (CD11b и CD18) и рецептора CD16 зафиксировали изменение степени их экспрессии на нейтрофилах у переболевших COVID-19 и продемонстрировали сохранение структурно-функциональных нарушений в последующем периоде. Так, доля и абсолютное число CD11b⁺ нейтрофилов в крови лиц, переболевших COVID-19, достоверно превышали показатели для не болевших (40,03±7,65 % и 26,13±5,79 %, p < 0,001, рис. 2А). Также, относительное (p < 0,01) и абсолютное (p < 0,01) содержание нейтрофилов, несущих низкоаффинный рецептор для Fc-фрагмента иммуноглобулинов G (FcγRIII, CD16), у пациентов с ранее перенесенной коронавирусной инфекцией достоверно превышало число таких клеток у лиц не болевших COVID-19 (рис. 2Б). CD16 – это единственный Fc-рецептор (FcγRIIIb), который связан с гликозилфосфатидилинозитолом (GPI), который имеет важную роль в метаболизме клетками ионов Ca²⁺. Помимо этого, данный рецептор задействован в дегрануляции нейтрофилов, фагоцитозе и окислительном взрыве, которые обеспечивают удаление опсонизированных патогенов [8]. Несмотря на высокое количество CD18 позитивных нейтрофилов у переболевших COVID-19 (97,83±1,41 % и 94,08±3,88 %, p < 0,05), значимых различий в их абсолютном числе не обнаружено (p > 0,05, рис. 2В).

Рис. 2. Фенотипическая характеристика нейтрофилов крови обследованных лиц переболевших (1-я группа) и неболевших COVID-19 (2-я группа), абсолютное количество CD11b⁺ (А), CD16⁺ (Б) и CD18⁺ (В) клеток

Примечание: * различия между показателями достоверны при р < 0,05; ** при р < 0,01.

Коронавирусная инфекция COVID-19 характеризуется глубоким нарушением функциональности врожденной иммунной системы [14, 20]. На настоящий момент понимание механизма реализации процесса воздействия на иммунопатогенез заболевания дисфункциональных клеточных факторов этой системы находится на начальном этапе [16, 18, 20]. Вирус SARS-CoV-2 и его молекулы активируют специфические рецепторы распознавания паттернов, вызывая защитные реакции клеток с последующим синтезом ими интерферона и цитокинов, гиперпродукция которых вызывает патологические реакции в месте внедрения вируса. Эти пути модулируются, с одной стороны, взаимодействием между вирусом и клеткой, а с другой – восприимчивостью организма к стрессовой ситуации [5, 6, 13]. При исследовании структурно-функциональных характеристик клеток врожденного иммунитета у лиц, перенесших COVID-19, отмечается достоверное уменьшение числа моноцитов классической субпопуляции и увеличение неклассического компартмента, что свидетельствует о долгосрочном сохранении провоспалительной конфигурации этих клеток. Повышенное абсолютное и удельное число моноцитов и нейтрофилов, экспрессирующих на своей поверхности маркеры адгезии (CD11b⁺ и CD18⁺), демонстрирует сохранение их активированного состояния длительный период. Наши результаты подтверждают, что устойчивая воспалительная реакция со стороны клеток врожденного иммунитета после перенесенного заболевания COVID-19 продолжается. Приобретение иммунорегуляторного фенотипа миелоидными клетками и нейтрофилами может способствовать дальнейшей напряженности иммунной системы в постковидный период. Молекулярные механизмы такой активации требуют дальнейшего изучения, но возможные варианты включают персистенцию антигена, инициацию аутоиммуных процессов, обусловленную антигенной перекрестной реактивностью. Кроме того, такие исследования могут дать информацию о тонком балансе между защитными и дисфункциональными реакциями клеток при различных заболеваниях.