Прогностическая значимость уровня цитокинов в определении тяжести течения и исходов новой коронавирусной инфекции

Полный текст

Введение: Новая коронавирусная инфекция (COVID-19) является заболеванием, поражающим несколько систем органов, особенно при тяжелом течении, патогенез которого включает нарушение регуляции функционирования  макрофагов, нейтрофилов, Т- и В-клеточного ответа, высвобождение провоспалительных цитокинов в сочетании с цитопатическим ответом вируса, индуцирующего прогрессирующее системное воспаление, высокое содержание нейтрофилов и падение количества лимфоцитов [1, 16]. При определении тяжести состояния и выборе терапии в лечении госпитализированных пациентов используется изучение провоспалительных маркеров ответа, таких как уровень лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, С-реактивного белка (СРБ), ферритина, D-димера.

У пациентов с COVID-19 в сыворотке крови в качестве сигнальных белков выявлены высокие уровни некоторых интерлейкинов, факторов роста эндотелия, и другие провоспалительные хемокины [2, 14]. Цитокиновый шторм при тяжелой форме заболевания [3, 4, 5], наряду с другими осложнениями (особенно лимфопения) связан с повышенным риском развития острого респираторного дистресс-синдрома синдром и полиорганной недостаточности [6, 7]. Угнетение Т-клеточного иммунитета вследствие персистенции вируса, а также нарушение действия интерферонов приводит к иммуносупрессии и отсутствию вирусного контроля, с дополнительными воспалительными реакциями, вызванные повреждением молекулярного паттерна (DAMP), высвобождаемого из поврежденной ткани [8, 9, 10]. Лонгитудинальные исследования во время прогрессирования заболевания могут быть полезными для лучшего понимания иммунной токсичности и иммуносупрессии [11], особенно когда ингибиторы иммунного ответа являются вариантом выбора терапии.

Период от начала до прогрессирования заболевания важен для проведения прогностических и терапевтических мероприятий. Предполагается, что от начала заболевания до появления симптомов составляет 7 дней, характеризуется наличием и выделением вируса (вирусной фаза), за которой следует ранняя воспалительная фаза, имеющая тенденцию к прогрессированию. Результатом дальнейшего прогрессирования воспаления и формирования иммунного ответа в течении 16 дней (поздняя воспалительная фаза) являются тяжелые легочные и системные нарушения, которые могут привести к летальному исходу [10, 11]. Множество исследований показали необходимость оценки отношения цитокинов (а именно IL-6:IL-10) для прогнозирования тяжелых и критически тяжелых состояний при COVID-19 [11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]. Среди большого числа маркеров воспаления наиболее исследованными являются IL-6, IL-8, IL-1b и TNFα. Одно из наиболее крупных исследований оценивало уровень указанных цитокинов в сыворотке у 1484 госпитализированных пациентов с диагнозом COVID-19 и выявило устойчивую связь между уровнями IL-6, IL-8 и TNF-a и летальным исходом [12, 13, 14, 16, 17, 18, 20].

В нашем исследовании нами проведен анализ уровня ряда провоспалительных цитокинов у 617 пациентов инфицированных SARS-CoV-2, для оценки острой воспалительной реакции и проведением корреляционного анализа связи с клиническими исходами COVID-19.

Материалы и методы: В исследование было включено 617 пациентов с подтвержденной новой коронавирусной инфекцией, госпитализированных в инфекционный госпиталь Клиники БГМУ в 2020-2021 году. Пациенты были в возрасте от 59 до 78 лет, мужского пола 255 (41,3%) и женского пола - 362 (58,7%). Пациенты были распределены в соответствии с временными клиническими рекомендациями новой коронавирусной инфекции (COVID-19) (Версия 18 от 26.10.2023) по группам: средней степени тяжести (n=502), тяжелого течения (n=67) и крайне тяжелого течения (n=30), отдельно была выделена группа пациентов с летальным исходом (n=18). Проведен анализ исходов госпитализации пациентов (выписано пациентов -523, умерло – 93 пациента) и уровней цитокинов, взятых в 1 й день госпитализации. Терапия, проводимая пациентам при госпитализации – фавипиравир - 109 (47,0%), ингибиторы ИЛ-6 в комбинации с фавипиравиром - 92 (39,7%), ингибиторы ИЛ-6 - 31 (13,4%).

Для отбора пациентов в исследование были разработаны критерии включения и исключения.

Критерии включения: мужчины и женщины старше 18 лет с диагнозом COVID-19, подтвержденным методом полимеразной цепной реакции, в тяжелом и крайне тяжелом состоянии; наличие инфильтратов в легких по данным компьютерной томографии (КТ) органов грудной клетки (степень повреждения легких (> 50%).

Критерии исключения: отказ пациента от участия в исследовании на любом его этапе.

Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Клиническое исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» и Правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными Приказом Минздрава России от 19.06.2003 № 266. Всем испытуемым проводился общеклинический анализ крови (ОАК), включавший оценку содержания эритроцитов, уровень гемоглобина, а также общее количество лейкоцитов с лейкоцитарной формулой.

Материалом исследования служила периферическая кровь. Для обследования у пациентов производился забор венозной крови в объёме 5 мл. В последующем получение сыворотки производилось путем центрифугирования венозной крови в течение 15 минут при 1000 оборотах не позднее 30 минут от момента сбора крови. Замораживалась и хранилась при температуре - 70°С. В сыворотки крови определяли концентрации 6 молекул: (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IFNα, IFNγ. Исследование проводили методом иммуноферементного анализа в АО «Вектор-Бест» (Россия, Новосибирск) согласно инструкции фирмы-производителя. Регистрацию данных проводили на автоматическом анализаторе «Лазурит» (АО «Вектор-Бест»).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы STATISTICA 10 (StatSoftInc., США). Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 4.0.7 (разработчик - ООО "Статтех", Россия). Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка (при числе исследуемых менее 50) или критерия Колмогорова-Смирнова (при числе исследуемых более 50). В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1 – Q3). Для оценки диагностической значимости количественных признаков при прогнозировании определенного исхода, применялся метод анализа ROC-кривых.

Результаты:

В результате проведенного исследования, было обнаружено, что в группе пациентов с летальным исходом преобладали пациенты старше 65 лет (n=93) (Табл. №1). Группе пациентов с летальным исходом соответствовали большие медианные значения возраста - 75 [68;86] против 69 [57;77]. Проведенный ROC анализ выявил, что пороговое значение возраста 74 является предиктором неблагоприятного исхода у пациентов с COVID-19 любого пола (рис.1,2).

 

Таблица 1

Анализ исхода терапии в зависимости от возраста

Показатель	Исход	Возраст			p
		Me	Q₁ – Q₃	N
Результат лечения	выписка	69	57 – 77	524	< 0,001*
	смерть	75	68 – 86	93

* – различия показателей статистически значимы (p < 0,05)

 

 

 

Рис. 1. ROC-кривая, характеризующая зависимость вероятности исхода лечения от возраста

 

 

Рис. 2. Анализ чувствительности и специфичности модели в зависимости от пороговых значений возраста

 

При анализе койко-дней в зависимости от результата лечения (выписанные и умершие), выявлены статистически значимые различия (p = 0,042) (95% ДИ: 0,505 – 0,628). Пороговое значение койко-дней в точке cut-off, которому соответствовало наивысшее значение индекса Юдена, составило 13,000. Смерть прогнозировалось при значении койко-дней ниже данной величины (Табл. 2.). В представленных результатах исхода лечения в зависимости от перевода в отделение интенсивной терапии (Табл. 3), выявлено существенные различия (p <0,001). Шансы смерти в группе госпитализированных в ОРИТ были выше в 288,353 раза, по сравнению с группой пациентов, не госпитализированных в ОРИТ (95% ДИ: 120,305 – 691,136).

 

Таблица 2

Анализ койко-дней в зависимости от результата лечения

Показатель	Исход	Койко-дней			p
		Me	Q₁ – Q₃	N
Результат лечения	выписка	9,00	7,00 – 13,00	504	0,042*
	смерть	9,00	6,00 – 11,00	92

* – различия показателей статистически значимы (p <0,05)

 

Таблица 3

Анализ результата лечения в зависимости от госпитализации в ОРИТ

Показатель	Исход	ОРИТ		p
		Нет	Да
Результат лечения	выписка	516 (96,8)	8 (9,5)	<0,001*
	смерть	17 (3,2)	76 (90,5)

* – различия показателей статистически значимы (p <0,05)

 

Результаты определения концентрации цитокинов у больных COVID-19 в острой фазе заболевания представлены в табл. 4.

В сыворотке крови больных COVID-19, находящихся в острой фазе заболевания, по сравнению с контрольной группой достоверно повышенные уровни обнаружены для 2 из 6 анализируемых цитокинов. Среди них провоспалительные цитокины: IL-6, повышенный в 1,92 раза (р <0,0001), IL-8 в 9,2 раза (р <0,0001).

Проведенный анализ уровня цитокинов показал статистически значимое отличие уровня IL-6 и IL-10 у пациентов средней степени тяжести по сравнению с тяжелыми, крайне тяжелыми и умершими пациентами (p <0.001). Уровень цитокинов IFN-γ пациентов средней степени тяжести значимо был ниже по сравнению с группой умерших пациентов (p <0,024).

Уровень IL-1 и IL-8, и IFN-α, и IFN- γ не показал статистически значимых различий, однако уровень данных цитокинов был значимо меньше по сравнению с группой контроля (p <0,005).

 

Таблица 4

Уровень цитокинов в зависимости от степени тяжести заболевания

Цитокины (pg/ml)	Контроль (n=30)	Тяжесть течения заболевания
		Средней тяжести (n=502)	Тяжелое (n=67)	Крайне-тяжелое (n=30)	Смерть (n=18)	р
IL-1 (0-11)	23,7 12,5-35,2	1,22 0,37736 – 2,92308	1,67 0,84906 – 3,42593	2,69 2,24537 – 2,88784	1,44 1,10577 – 3,73657	0,226
IL-6 (0-10)	2,2 1,6-3,2	16,12 4,56615 – 49,34132	42,49  11,86772 – 119,59248	42,96 23,54699 – 84,89576	131,95 27,65678 – 259,63145	<0,001* pсредней тяжести – Клиническая смерть = 0,002 pсредней тяжести – Крайне тяжелое = 0,010 pсредней тяжести – тяжелое <0,001
IL-8 (0-10)	33,5 26,7-41,6	90,88 44,299 – 205,236	94,03 44,898 – 214,490	109,23 74,697 – 262,645	114,88 62,974 – 313,602	0,216
IL-10 (0-10)	10,6 7,4-15,4	5,71 2,70833 – 10,00000	10,28 5,81140 – 19,84283	18,22369 11,21528 – 35,90550	16,99 11,49134 – 24,22577	<0,001* pсредней тяжести – Клиническая смерть <0,001 pтяжелое – Крайне тяжелое = 0,023 pсредней тяжести – Крайне тяжелое <0,001 pсредней тяжести – тяжелое <0,001
IFN-α (0-20)	72 38,3-86,9	0,00 0,00000 – 4,16667	1,09 0,00000 – 7,75172	1,19 0,00000 – 10,93750	0,00 0,00000 – 2,88577	0,100
IFN-γ (0-20)	26,7 21,8-36,1	0,00000 0,00000 – 0,87719	0,00000 0,00000 – 2,80000	0,00000 0,00000 – 0,00000	6,00000 0,40202 – 13,61651	0,024* pсредней тяжести – Клиническая смерть = 0,026

 

Проведенный анализ уровня исследуемых цитокинов в зависимости от исходов терапии представлен в табл. 5 и выявил значимые отличия уровней IL-6, IL-10, IFN-alfa в группе выписанных пациентов против умерших.

 

Таблица 5

Анализ уровня цитокинов в зависимости от исходов

Показатель	Исход	Me	Q₁ – Q₃	n	p
IL-1	Выписка	1,24	0,38 – 3,14	187	0,079
	Смерть	1,79	1,28 – 2,81	20
IL-6	Выписка	16,98	4,68 – 54,55	523	<0,001*
	Смерть	44,06	15,68 – 131,02	93
IL-8	Выписка	91,02	43,69 – 207,37	523	0,105
	Смерть	98,95	59,26 – 218,42	93
IL-10	Выписка	5,79	2,75 – 10,01	523	<0,001*
	Смерть	17,64	9,55 – 27,68	93
IFN-α	Выписка	0,00	0,00 – 4,17	523	0,035*
	Смерть	1,09	0,00 – 9,72	93
IFN-γ	Выписка	0,00	0,00 – 0,92	187	0,304
	Смерть	0,00	0,00 – 6,40	20
	Смерть	5615,32	4521,37 – 6703,43	92

* – различия показателей статистически значимы (p <0,05)

                                                                                                    

Согласно полученным данным при анализе IFN-alfa в зависимости от результата лечения, нами были установлены статистически значимые различия (p=0,035).  Площадь под ROC-кривой составила 0,564 ± 0,033 с 95% ДИ: 0,499 – 0,629. Пороговое значение IFN-alfa в точке cut-off, которому соответствовало наивысшее значение индекса Юдена, составило 7,292. Смерть прогнозировалось при значении IFN-alfa выше данной величины или равном ей. Чувствительность и специфичность модели составили 31,2% и 81,8%, соответственно. (Рис. 3,4)

 

Рисунок 3.  Анализ IFN-alfa в зависимости от результата лечения

Рисунок 4. ROC-кривая, характеризующая зависимость вероятности результата лечения

от IFN-alfа

 

Анализ уровня IL-10 в зависимости от результата лечения, выявил статистически значимые различия (p <0,001). Площадь под ROC-кривой составила 0,827 ± 0,027 с 95% ДИ: 0,774 – 0,881. Пороговое значение IL-10 в точке cut-off, которому соответствовало наивысшее значение индекса Юдена, составило 8,796. Смерть прогнозировалось при значении IL-10 выше данной величины или равном ей. Чувствительность и специфичность модели составили 81,7% и 70,4%, соответственно. (Рис. 5,6)

 

Рисунок 5. Анализ IL-10 в зависимости от результата лечения

 

Рисунок 6. C-кривая, характеризующая зависимость вероятности результата лечения от IL-10

 

В результате сравнения IL-6 в зависимости от результата лечения, были установлены существенные различия (p <0,001). Площадь под ROC-кривой составила 0,665 ± 0,033 с 95% ДИ: 0,601 – 0,729. Пороговое значение IL-6 в точке cut-off, которому соответствовало наивысшее значение индекса Юдена, составило 23,061. Смерть прогнозировалось при значении IL-6 выше данной величины или равном ей. Чувствительность и специфичность модели составили 69,9% и 57,6%, соответственно. (Рис. 7)

 

Рисунок 7. ROC-кривая, характеризующая зависимость вероятности результата лечения от IL-6.

 

             Анализ уровня следующих цитокинов в зависимости от исходов заболевания не показал статистически значимых отличий - IFN- γ (p = 0,304), IL-1бета (p = 0,079) и IL-8 (p = 0,105). (Табл. №5)

Обсуждение:

Проведенный анализ пациентов с новой коронавирусной инфекцией в острой фазе заболевания показал, что пациенты старше 68 лет преобладали в популяции пациентов с летальным исходом. Проведенный ROC анализ выявил, что пороговое значение возраста 74 является предиктором неблагоприятного исхода у пациентов с COVID-19 любого пола. По данным многочисленных исследований у пациентов с COVID-19, старший возраст является основным прогностическим признаком не благоприятного исхода заболевания.

Проведенный анализ койко-дней в зависимости от исхода лечения (выписанные и умершие), выявил статистически значимые различия (p = 0,042). Пороговое значение койко-дней в точке cut-off, которому соответствовало наивысшее значение индекса Юдена, составило 13,000. Смерть прогнозировалось при значении койко-дней ниже данной величины, что может говорить о необходимости пребывания пациента в стационаре не менее 13 койко-дней, для предупреждения осложнений и повторных госпитализаций.  

Анализ результатов лечения в зависимости от перевода в отделение интенсивной терапии, выявил существенные различия (p<0,001). Шансы смерти в группе госпитализированных в ОРИТ были выше в 288,353 раза, по сравнению с группой пациентов, не требующих перевода в ОРИТ. Данный факт подтверждает необходимость предупреждения развития ОРДС, как основную причину летального исхода у больных COVID-19.

Результаты нашего исследования свидетельствуют об увеличении уровня ряда цитокинов в сыворотке крови больных COVID-19 в острой фазе заболевания по сравнению с контролем, среди которых провоспалительные цитокины IL-6, IL-8. Анализ уровня цитокинов с учетом степени тяжести заболевания выявил значимое отличие уровня IL-6, IL-10  у пациентов средней степени тяжести по сравнению с тяжелыми, крайне-тяжелыми и умершими пациентами (p<0,001). Уровень цитокинов IFN-γ пациентов средней степени тяжести значимо был ниже по сравнению с группой умерших пациентов (p <0,024).

Уровень IL-1 и IL-8, IFN-α и IFN- γ не показал значимых отличий в исследуемых группах пациентов в зависимости от тяжести состояния. Однако уровень данных цитокинов был значимо меньше по сравнению с группой контроля (p<0,005). Данный факт описан в публикациях разных исследователей, как основной фактор иммунопатогенеза COVID-19 свидетельствующий о нарушении иммунного ответа по отношению к возбудителю с недостаточным синтезом интерферонов в начальном периоде болезни, а также с последующей гиперпродукцией провоспалительных цитокинов, служащей причиной гиперергического воспаления в лёгочной ткани, поражения лёгких и острого респираторного дистресс-синдрома [12, 13, 14, 16, 17, 18]. Можно предположить, что SARS-CoV-2 обладает способностью не только снижать абсолютное количество IFN I и II типов в сыворотке крови, но и вызывать снижение функционального состояния интерфероновой системы в виде резкого угнетения её биологической активности [5–8, 11, 16, 17].

Участие IL-1 в патогенезе коронавирусной инфекции имеет опосредованное значение, несмотря на наличие терапевтических агентов на основе IL-1 используемых в терапии COVID-19 [14, 18, 19]. Роль IL-8 в патогенезе COVID-19 описана в значительном количестве публикаций и подтверждает его клиническое значение в прогнозировании тяжести и неблагоприятного исхода заболевания у пациентов, госпитализированных в ОРИТ [15].

Проведенный анализ уровня исследуемых цитокинов в зависимости от результатов лечения выявил значимые отличия уровней IL-6, IL-10, IFN-alfa в группе выписанных пациентов в сравнении с пациентами с летальным исходом. Методом анализа ROC-кривых выявлено, что смерть прогнозировалось при значении IFN-alfa выше 7,292 или равном ей, для IL-10 - 8,796, IL-6 - 23,061. Анализ уровня следующих цитокинов IFN-γ, IL-1бета и IL-8 в зависимости от исходов заболевания не выявил статистически значимых отличий.

Заключение:

Иммунологическая реакция, вызванная заражением SARS-CoV-2, вовлекает преимущественно многочисленные провоспалительные цитокины. Острая фаза заболевания сопровождается значительным повышением уровня цитокинов в сыворотке крови, как провоспалительных, так и противовоспалительных. Анализ уровня цитокинов нашего исследования выявил повышение уровней IL-6, IL-10  в зависимости от исхода и от степени тяжести заболевания. Данные цитокины могут служить маркерами развития тяжелого течения COVID-19. Полученные результаты низкого уровня IFN-α и IFN- γ подтверждают необходимость проведения противовирусной терапии в комбинации с терапией, направленной на подавление цитокинового шторма.

Об авторах

Алина Артуровна Набиева

Башкирский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: alin4ik.nabieva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2079-1503

Ассистент кафедры, врач гематолог

Россия

Булат Ахатович Бакиров

ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: bakirovb@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3297-1608
Scopus Author ID: 6506849196
ResearcherId: М-6491-2018

Россия, 450008, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. Ленина, д. 3;

Дмитрий Анатольевич Кудлай

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет);
Московский государственный университет имени М.В.Ломоносов;
ФГБУ “ГНЦ Институт иммунологии” ФМБА России

Email: zakharochkina_e_r@staff.sechenov.ru
ORCID iD: 0000-0003-1878-4467

д-р мед. наук, проф. каф. фармакологии Института фармации им. А.П. Нелюбина

Россия, Москва

Валентин Николаевич Павлов

Email: pavlov@bashgmu.ru

Эдуард Феликсович Аглетдинов

АО “Вектор-Бест”

Email: agletdinov@vector-best.ru
ORCID iD: 0000-0002-6256-2020

д.м.н., Заместитель генерального директора по научной работе АО “Вектор-Бест”

Россия, Новосибирск

Список литературы

Дополнительные файлы