Influence of metabolic acidosis on erythrocyte addrenoreactivity in newborn

Full Text

Введение

Исследование различных показателей гомеостаза у новорожденных детей является важным направлением в перинатологии [4]. Перинатальная гипоксия в зависимости от степени тяжести вызывает различные изменения гомеостаза, способствующие нарушениям центральной гемодинамики и церебрального кровотока, развитию шока, дыхательной недостаточности в неонатальном периоде [14]. Частота встречаемости асфиксии тяжелой степени находится в диапазоне от 0,5 до 6‰ живорожденных [13].

Важнейшим компонентом нейрогуморальной регуляции функций организма как в норме, так и при развитии гипоксии, нарушениях гомеостаза является симпатоадреналовая система (САС). Адренореактивность (АРМ) отражает реакции организма в ответ на изменение САС и является системным показателем адренореактивности организма. Связывание адренорецепторов с адренергическими веществами вызывает функциональные изменения в клетках [6]. Эритроидные ядросодержащие клетки – это самая значительная клеточная популяция, составляет 84 % от общего клеточного состава. Эритроциты являются перспективным объектом научных исследований об адренорецепторах организма. Их функции многочисленны и важны в инфекционной и неинфекционной патологии [10]. Цитозольный протеом эритроцитов на 90 % состоит из гемоглобина [9], благодаря которому они выполняют буферную функцию, активно участвуют в метаболизме катехоламинов, ацетилхолина, иммунных комплексов и ряда лекарственных веществ. Результаты исследований, полученные при разных методах определения функционального состояния адренорецепторов мембраны эритроцитов, вносят новые представления о физиологии эритроцитов, об особенностях адренореактивности организма, функциональных свойств в норме и при различной патологии, что может помочь врачу сделать правильный выбор патогенетического лечения и контролировать эффективность назначенной терапии [3]. По уровню адренореактивности клеток можно судить о развитии стрессовой ситуации в организме, которая возникает в процессе его адаптации к новым экстремальным условиям среды, в том числе при рождении.

Под влиянием длительной или сильной стимуляции катехоламинами, например, при гипоксии, адренорецепторы могут изменяться количественно и функционально, способствуя десенситизации мембран к стрессорным медиаторам и гормонам. Адренорецепторы представляют собой специфический, но не стабильный компонент клеточной мембраны. Это позволяет считать β-АРМ системным показателем адренореактивности организма. Функциональное состояние детекторного звена САС находится под контролем обратной связи с количеством адреноактивных веществ, которые действуют на клетку [8, 11]. В настоящее время не существует универсальных тестов, позволяющих дать исчерпывающий ответ на все вопросы относительно оценки здоровья и функционального состояния организма [7].

Важную роль в оценке новорожденного играют газовый состав и кислотно-основное состояние (КОС) крови. Данные исследований позволяют оценить степень тяжести и длительность гипоксии, при которой изменяется системное и региональное кровообращение, приводящее к нарушениям в кислотно-основном состоянии крови: респираторному или метаболическому ацидозу. Ацидоз, определяемый при рождении, используется в качестве критерия степени тяжести асфиксии. Декомпенсированный метаболический ацидоз ассоциирован с высокой смертностью и, в случае выживаемости детей, неврологическими расстройствами, проявляющимися в различные периоды жизни [1, 12]. рН крови – это важная характеристика кислотно-основного гомеостаза. Только узкий диапазон нормальных значений рН обеспечивает физиологические метаболические процессы. Изменение рН за пределы нормальных величин приводит к появлению патологических изменений, влияющих на функцию клетки, в том числе эритроциты. Чем сильнее выражены эти изменения, тем больше меняется гомеостаз организма. Определение рН в остаточной пуповинной крови (ОПК) представляет научно-практическую ценность в выявлении степени тяжести перинатальной гипоксии и степени ацидоза плода и новорожденного, а также позволяет разрабатывать стратегию лечения и коррекцию выявленных нарушений. Изучение адренореактивности организма и возможности использования величин этих показателей может стать еще одним критерием степени тяжести перинатальной гипоксии у новорожденных.

Целью работы является изучение показателей адренореактивности в остаточной пуповинной крови доношенных новорожденных, в зависимости от cтепени ацидоза.

Материалы и методы

Материалом исследования служила остаточная пуповинная кровь, полученная сразу после пересечения пуповины 58 доношенных новорожденных, родившихся через естественные родовые пути со сроком гестации 38-41 неделя. В зависимости от величины адренореактивности эритроцитов, определенной в ОПК, выделены три группы исследования:

• группа А – 9 новорожденных, у которых показатели адренореактивности эритроцитов находились в диапазоне от 4 до 25 усл. ед., средняя масса тела составляла 3316±78,7 г;
• группа В – 23 новорожденных, у которых показатели адренореактивности эритроцитов находились в диапазоне от 25 до 51 усл. ед., средняя масса тела составляла 3317±83,6 г;
• группа С – 26 детей, у которых показатели адренореактивности эритроцитов были выше 51 усл. ед., средняя масса тела 3428±61,4 г.

По массе тела при рождении достоверных отличий между группами не выявили (р>0,05).

Кислотно-основное состояние крови оценивали на биохимическом анализаторе АВL серии 700, фирма RADIOMETER, США, 2000 г. С применением гепаринизированных шприцев, рекомендованных фирмой-производителем аппаратов, на которых проводилось дальнейшее исследование материала. Определяли рН, напряжение углекислого газа рСО₂ и дефицит буферных оснований ВЕ. Измеряли с помощью ионоселективных электродов, калибровали их по растворам с известным содержанием электролитов и растворенных газов. Во время анализа образцы крови находились внутри электродов при температуре 37 ^оС и были защищены от окружающего воздуха. На протяжении всего периода исследований ежедневно проводили контроль качества с применением контрольных образцов, содержащих параметры на низком, среднем и высоком уровнях. Исключали наличие пузырьков воздуха, перемешивая пробы с помощью магнита в капиллярах, избегая его встряхивания. Исследование проводили в первые 10 мин. после взятия пробы. Во избежание ошибок вели контроль температуры в помещении 24-26 ^оС, относительной влажности до 85 %.

Исследование адренореактивных свойств эритроцитов определяли по методу Р.И. Стрюк и И.Г. Длусской [6] с использованием наборов «Бета-АРМ-Агат». Реакцию эритроцитов на адреноблокатор определяли дважды во всех пробах. Определяли распад эритроцитов в забуференном рабочем растворе. Цельную кровь с антикоагулянтом разводили физиологическим раствором 1:1 и вносили 0,05 мл приготовленного биологического материала в 2,5 мл буферного раствора (разведение цельной крови составляло 1:51). Перемешивали трехкратно, избегая пенообразования. Инкубацию проводили в течение 15 мин. при комнатной температуре 20-23 ^оС. Надосадочную жидкость получали после центрифугирования проб в течение 10 мин. при 1500 об./мин. Величину оптической плотности надосадочной жидкости опытной пробы выражали в процентах от величины оптической плотности контрольной пробы. Единицы процентов принимали за условные единицы β-АРМ.

Полученные результаты были обработаны методами дескриптивной и непараметрической статистики с использованием пакета программ Statistica 6.0. Отличия считали достоверными при уровне статистической значимости р<0,05.

Результаты и обсуждения

Степень выраженности ацидоза при рождении является маркером тяжести перинатальной гипоксии. Для этого используются следующие диагностические критерии ацидоза, определяемые в ОПК: рН, ВЕ и рСО₂.

В исследовании установлено, что в группах А и В величина рН соответствовала ацидозу легкой степени, достоверно не отличалась между этими группами (р>0,05). Для новорожденных группы С характерен ацидоз тяжелой степени, величина рН была статистически значимо ниже по сравнению с группами А и С (р=0,009), В и С (р=0,0001) (рис. 1).

 

Рис. 1. Уровень рН в остаточной пуповинной крови новорожденных # p<0,05 – статистически значимые отличия между группами А и С • p<0,05 – статистически значимые отличия между группами В и С

 

Другим важным показателем, определяющим характер ацидоза (дыхательный или метаболический), является избыток или недостаток буферных оснований (base excess, ВЕ). Для всех детей, включенных в исследование, характерен дефицит оснований, который определяет степень выраженности метаболического ацидоза. Если у детей группы А определялся субкомпенсированный ацидоз, то в группах В и С метаболические нарушения были наиболее выражены, для них характерен декомпенсированный ацидоз (рис. 2). Несмотря на различие в степени тяжести нарушений, статистически значимых отличий между группами не установлено (p>0,05).

 

Рис. 2. Уровень ВЕ в остаточной пуповинной крови новорожденных

 

В ОПК новорожденных групп А и В содержание рСО₂ находилось в пределах нормальных величин (рис. 3). В группе С уровень исследуемого показателя был повышен и статистически значимо отличался от групп А и В (соответственно р=0,05; р=0,04).

 

Рис. 3. Уровень рСО2 в остаточной пуповинной крови новорожденных # p<0,05 – статистически значимые отличия между группами А и С • p<0,05 – статистически значимые отличия между группами В и С

 

Таким образом, в группах регистрировался метаболический ацидоз различной степени. Наиболее глубокие нарушения характерны для новорожденных группы С.

В результате исследования выявлена высокая вариабельность показателя адренореактивности у новорожденных с различной степенью ацидоза (рис. 4). Самые низкие показатели адренореактивности эритроцитов определялись в группе А, в которой установлен метаболический ацидоз легкой степени. При нарастании ацидоза происходил рост β-АРМ, и максимальные изменения выявлены в группе С, в которой зарегистрирован декомпенсированный смешанный ацидоз тяжелой степени. Установлены статистически значимые различия между группами А и В (р<0,001), А и С (р<0,001), В и С (р<0,001).

 

Рис. 4. Адренореактивность эритроцитов новорожденных при рождении * p<0,05 – статистически значимые отличия между группами А и В # p<0,05 – статистически значимые отличия между группами А и С • p<0,05 – статистически значимые отличия между группами В и С

 

Проведенное исследование показало, что нарушение метаболических процессов в организме новорожденных сопровождалось активацией симпатоадреналовой системы в разной степени. При проведении корреляционного анализа выявлена обратная слабая связь между β-АРМ и рН (r= -0,232; р=0,001) в группе В, в группе С между этими показателями отмечена обратная умеренная связь (r=-0,39; р=0,001). Обратная умеренная корреляционная связь проявилась между β-АРМ и рСО₂ в группе В (r= -0,403; р=0,001) и слабая в группе С (r= -0,278; р=0,001), что свидетельствует о взаимосвязи этих показателей и влиянии друг на друга, чем меньше показатели рН, тем выше β-АРМ эритроцитов.

Повышенная устойчивость эритроцитов и функциональная активность мембраны наблюдалась у детей группы А. Высокая адренореактивность организма у новорожденных характеризовалась повышенной чувствительностью адренорецепторов клеточных мембран к увеличению уровня катехоламинов, целостность клеточных мембран эритроцитов при этом сохранялась. Субкомпенсированный ацидоз оказывал умеренное влияние на активность САС. Вариабельность показателя β-АРМ у детей группы А была в пределах 5-24 усл.ед., у 22 % детей резистентность эритроцитов под влиянием катехоламинов несколько снижалась, но сохранялась в пределах физиологической нормы [6].

В группе В отмечалось увеличение показателя адренореактивности, который по принципу биологической обратной связи характеризовал снижение системного показателя адренореактивности организма при умеренном увеличении содержания катехоламинов. Систематический выброс в кровь физиологически допустимых доз адреналина приводит к частичному снижению чувствительности адренорецепторов мембран эритроцитов к воздействию данного гормона. Это в свою очередь отражается на функциональных возможностях клеток, основной функцией которых является снабжение тканей кислородом.

В группе С у детей с глубокими нарушениями кислотно-основного состояния, обусловленными более выраженным дефицитом буферных оснований, повышением парциального давления углекислого газа, его накоплением и низкими показателями рН [2, 5], отмечались высокие цифры β-АРМ эритроцитов, что характеризует низкую адренореактивность организма.

Катехоламины являются гликопротеидами мембран эффекторных клеток, при взаимодействии с которыми они изменяют биохимические процессы в ней. Присутствующие на мембранах клеток крови α2- и β2-адренорецепторы быстро реагируют на изменение содержания катехоламинов. Целостность клеточной мембраны в местах контакта с β2-адренорецепторами при действии агониста нарушается. Известно, что в мембранах эритроцитов человека функционируют β-адренергические рецепторы, активирующие систему G-белка-аденилатциклазы и влияющие на гуанозинтрифосфат и на функциональное состояние мембран эритроцитов, синтез белков и гемоглобина. Изменение поверхности мембраны сопровождается интернализацией адренорецепторов с ее поверхности. В этих условиях, несмотря на уменьшение количества адренорецепторов при десенситизации, остающиеся адренорецепторы могут передавать сигнал агонистов на аденилатциклазу при условии защиты G-белка, которая может обеспечиваться, в частности, увеличением внутриклеточного Ca2+ или под действием ацетилхолина. Основное действие катехоламинов, опосредуемое β-адренорецепторами, направлено на стимуляцию энергетической системы клеток в соответствии с их органной специфичностью и обусловлено регуляцией ионного обмена в клетке. При активации или блокаде β2-адренорецепторов такая связь может обеспечить мгновенную перестройку ионообменных механизмов. Увеличение активности САС, характерное для детей группы С, может сопровождаться увеличением концентрации катехоламинов, изменяя количество и функциональное состояние адренорецепторов. Ингибирование осмолиза эритроцитов зависело от количества функционально активных β-адренорецепторов на поверхности клеток и указывало на их адренореактивность. Показатели β-АРМ Эр ОПК новорожденных группы С в 5 раз превышали показатели β-АРМ детей группы А. Высокая активность САС оказывала дестабилизирующее влияние на системный и клеточный уровни.

Выраженность физиологического эффекта катехоламинов определяется рядом факторов: освобождением их из синаптических нервных окончаний и мозгового вещества надпочечников, нейрональным и экстранейромальным обратным захватом катехоламинов, экстракцией, связыванием с тканевыми адренорецепторами, что в свою очередь зависит от плотности последних и степени их родства с катехоламинами плазмы. Функционирование САС зависит от внешних стрессорных воздействий и нарушения гомеостаза вследствие сочетания различных концентраций вырабатываемых катехоламинов, плотности и функциональной активности адренорецепторов.

Под влиянием сильной и длительной стимуляции катехоламинами меняется количество и функциональное состояние адренорецепторов. В нашем исследовании процесс десенситизации имел несколько стадий. Начальная стадия процесса с разобщением рецепторов с комплексами G-белок-аденилатциклаза без уменьшения количества адренорецепторов на поверхности мембраны отмечена у детей группы А с умеренной степенью выраженности ацидоза, что подтверждают низкие показатели адренореактивности эритроцитов. В условиях стресса у детей группы В и С начинали проявляться отрицательные последствия действия катехоламинов на системном и клеточном уровнях: защитная десенситизация адренорецепторов и ответный дополнительный выброс катехоламинов. Формирование такого порочного круга приводит к систематическому повышению активности САС, обратимому на первых этапах и устойчивому под действием этиопатогенетических факторов.

Нарастание метаболического ацидоза у детей группы В и С, ассоциировано со снижением адренореактивности, т. к. гипоксия клеток приводит к появлению ацидоза различной степени, нарушению гомеостаза, появлению трансформации поверхности мембран эритроцитов и изменению морфологических форм. Ряд исследований подтверждают наличие таких изменений у новорожденных, перенесших гипоксию [12].

В результате исследования нами выявлена слабая отрицательная связь между индивидуальными величинами β-АРМ и показателем рН. При этом в пределах более высоких показателей адренореактивности связь между уровнем β-АРМ и уровнем рН проявлялась слабо, усиливаясь по мере возрастания величин β-АРМ.

Новорожденные очень чувствительны к гипоксии и оксидативному стрессу, которые оказывают негативное влияние на организм в критическом состоянии, вызывая повреждение органов и систем. Симпатоадреналовая система обеспечивает в организме важные метаболические и физиологические процессы, из которых наиболее значимы углеводный обмен, катаболизм белков, окислительные процессы, гормональная активность и многие другие.

В нашем исследовании метод оценки адренореактивности эритроцитов по величине β-адренорецепции мембран эритроцитов выявил изменения функционального состояния эритроцитов в ответ на воздействие адренореактивного вещества и в зависимости от выраженности ацидоза проявлял эффект снижения или увеличения чувствительности эритроцитов. Десенситизация мембраны эритроцитов к действию адреналина проявилась адаптивной ответной реакцией организма при гипоксии. САС, осуществляя адаптационно-трофическую функцию, является сложным многоэтапным механизмом, активность которого зависит от биосинтеза катехоламинов, количества, функционального состояния адренорецепторов, от состояния сигналинг-системы.

Заключение

При воздействии внутриутробной перинатальной гипоксии изменение функционального состояния эритроцитов происходит уже внутриутробно. Уровень показателей β-АРМ эритроцитов зависит от тяжести и длительности гипоксии. Выявленные изменения адренореактивности организма свидетельствуют о влиянии степени гипоксии на гомеостаз, концентрацию вырабатываемых катехоламинов, чувствительность эритроцитов и нормальное функциональное состояние адренорецепторов. Интранатальный период характеризуется нестабильностью адренореактивности организма и большой вариабельностью показателей β-АРМ эритроцитов.

Изменение активности САС и деструктурирующее влияние ее на клеточные структуры крови, связанное с гипоксией, являются адаптивной ответной реакцией организма. Метод оценки функционального состояния адренорецепторов является одним из эффекторных звеньев этой системы и может найти применение не только в научных исследованиях, но и в практической медицине.

About the authors

O. D. Denisenko

IKBFU I. Kant

Email: cytokines@yandex.ru

biologist of the chemical and toxicological laboratory

Russian Federation, Kaliningrad

S. A. Perepelitsa

IKBFU I. Kant

Email: cytokines@yandex.ru

professor of the department of surgical disciplines, leading researcher, md, professor

Russian Federation, Kaliningrad

Larisa S. Litvinova

IKBFU I. Kant

Author for correspondence.
Email: larisalitvinova@yandex.ru

director of the Center for immunology and cellular biotechnologies, professor of the department of fundamental medicine, md, professor

Russian Federation, Kaliningrad

References

Supplementary files