THE LEVEL OF EXTRACELLULAR DNA AS AN INDICATOR OF THE ACTIVITY OF INFLAMMATORY REACTIONS IN PATIENTS WITH RHEUMATOID ARTHRITIS AND ASTHMA

Full Text

Введение

Результаты многочисленных клинических и экспериментальных исследований, предпринятых за последние двадцать лет, позволяют с большой степенью уверенности говорить о том, что одним из важных факторов, обусловливающих существенное повышение содержания внеклеточной ДНК (внДНК) в плазме крови больных с различной патологией, являются воспалительные реакции, играющие значимую роль в патогенезе исследуемых заболеваний. Связь уровня внДНК с развитием воспалительных процессов была показана при сепсисе, системной красной волчанке, ревматоидном артрите, инфаркте миокарда, а также в экспериментах при заражении подопытных животных инфекционными агентами [4, 8, 9, 11].  В нашем исследовании, выполненном на мышах линий C67Bl/6 и DBA/2, также было показано, что введение животным провоспалительного агента (ЛПС) уже в первые часы после воздействия приводит к существенному увеличению количества внДНК в плазме крови, причем прирост этого показателя непосредственно зависит от дозы вводимого препарата [3]. Таким образом, сегодня нет оснований для сомнений в том, что системная реакция воспаления может быть причиной повышенного содержания внДНК в крови и что во многих ситуациях измерение этого параметра способно служить одним из информативных показателей интенсивности протекающих в организме воспалительных реакций.

Конкретные патофизиологические механизмы, обусловливающие возрастание количества внДНК (и, соответственно, ее уровня в крови), еще мало изучены и обычно связываются с увеличенной гибелью клеток (путем некроза или апоптоза) при тех или иных заболеваниях. В то же время широкое распространение [10] получило представление о том, что существенным источником внДНК при воспалительных реакциях служит активация нейтрофильных лейкоцитов, приводящая к их нетозу – процессу выхода во внеклеточное пространство нитей ДНК, которые образуют сетевидные структуры, способствующие локализации и нейтрализации инфекции в очагах воспаления и скопления нейтрофилов. В ряде клинических и экспериментальных работ было показано, что активация нейтрофильного звена неспецифического иммунитета и усиление процесса нетоза сопровождается параллельным увеличением уровня внДНК в крови и других жидкостях тела у человека и животных [14].

Кроме этого, следует иметь в виду, что развитие воспалительных реакций и их интенсивность находятся под контролем иммунной системы, так что сдвиг баланса хелперов в сторону Th1-лимфоцитов, продуцирующих провоспалительные цитокины, является постоянным элементом реакций организма на индуцирующие воспаление внешние воздействия и его выраженность во многом определяет патогенез воспалительных процессов при различных заболеваниях. Исходя из такого общепринятого взгляда на регуляцию воспалительных реакций, естественно ожидать, что во многих случаях изменения уровня внДНК в крови могут быть значимо связаны с величиной Th1/Th2-соотношения в организме и до определенной степени отражать различия в балансе хелперов при развитии различных патологических процессов. В ранее выполненной нами экспериментальной работе [5] было обнаружено, что динамика содержания внДНК в плазме крови индивидуальных  подопытных мышей в ответ на введение малых доз ЛПС статистически связана с развитием у этих животных одного из оппозитных вариантов хронической РТПХ, что определяется исходным преобладанием Th1- или Th2-зависимых иммунных реакций в период индукции РТПХ. Эти данные можно рассматривать как косвенное свидетельство в пользу наличия патогенетической связи между состоянием Th1/Th2-баланса в организме и изменениями уровней внДНК в крови при некоторых патофизиологических процессах, но, разумеется, этот вопрос еще требует тщательного изучения.

Основываясь на вышеизложенных представлениях, нами было запланировано и выполнено клинико-лабораторное обследование пациентов с ревматоидным артритом (РА) и бронхиальной астмой (БА), проходивших курс терапии в ревматологическом и аллергологическом отделениях клиники иммунопатологии НИИФКИ.  Основные результаты проведенного обследования пациентов с РА и БА были опубликованы ранее в двух отдельных сообщениях [1 и 2, соответственно]. Целью настоящей работы является анализ полученных данных и сопоставление изменений уровней внДНК при патологических состояниях, тесно связанных со сдвигами баланса хелперов в сторону Th1- или Th2-клеток, а также зависимостей, существующих в этих условиях, между внДНК и другими показателями интенсивности воспалительных реакций, включая степень активации нейтрофильных лейкоцитов, как звена неспецифического иммунитета. 

 

Материалы и методы

Характеристика пациентов:

В анализ были включены 63 пациента с ревматоидным артритом и 20 пациента с бронхиальной астмой, находившиеся на стационарном лечении в клиники иммунопатологии НИИФКИ (г.Новосибирск).

Исследованная группа пациентов РА состояла из 54 женщин (85%) и 9 мужчин (15%) в возрасте от 22 до 83 лет (медиана – 55 лет). По степени активности заболевания исследуемые были разделены на три группы: 1 – с низкой активностью (DAS-28 < 3,2), 2 - с умеренной (DAS-28 – от 3,2 до 5,1) и 3 - с высокой активностью (DAS-28 > 5,1). Исследованная группа пациентов с БА состояла из 12 женщин (60%) и 8 мужчин (40%) в возрасте от 27 до 59 лет. По длительности заболевания от 1 года до 40 лет. Забор крови производился двукратно: в момент поступления и через 10 дней со дня госпитализации. Право на участие в исследовании подтверждалось письменным информированным согласием. Протокол обследования был одобрен локальным этическим комитетом.

В исследование включены 28 образцов от условно здоровых доноров, набранных на Пункте забора донорской крови ГКБ №1 г. Новосибирска.

Методы исследования

Выделение внеклеточной ДНК. Забор периферической крови для проведения анализа осуществлялся с помощью венозной пукнции в вакуумную пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА).

Плазму отделяли от форменных элементов центрифугированием при 400g в течение 20 мин [13]. Выделение внеклеточной ДНК из плазмы проводили на колонках компании «БиоСилика» (Новосибирск) согласно инструкции по применению «Набора для выделения ДНК из плазмы крови». Для определения внДНК, связанной с клеточной поверхностью, клетки инкубировали 5 мин с 0,25 % раствором трипсина, реакцию останавливали добавлением ингибитора трипсина из соевых бобов (Sigma, США) и центрифугированием отделяли супернатант, содержащий внДНК. Определение ДНК проводили с помощью флюоресцентного красителя PicoGreen (Invitrogen). Концентрация ДНК пересчитывалась по калибровочной кривой, построенной для известных концентраций стандартной двуцепочечной λ ДНК.

Выделение нейтрофилов. Периферическую кровь у доноров и пациентов с ревматоидным артритом забирали в утренние часы натощак в пропиленовые пробирки с гепарином (20 ME/мл крови). Нейтрофилы выделяли с помощью центрифугирования в двойном градиенте плотности фиколл-урографин (ρ = 1,077 г/см³ и ρ = 1,119 г/см³) при 400g 25 мин. Полученное кольцо нейтрофилов переносили в пробирки и трижды отмывали в 5 мл PBS, центрифугируя при 200g 10 минут, а затем ресуспендировали в культуральной среде, включающей RPMI-1640 без фенолового красного с добавлением 1% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки. Нейтрофильные лейкоциты составляли более 98%  во фракции выделенных клеток, а их жизнеспособность составляла 99%, что определялось тестом с трипановым синим.

Определение спонтанного и стимулированного нетоза нейтрофилов in vitro.  Свежевыделенные нейтрофилы переносили в черный планшет в концентрации 2 х 10⁵ клеток на лунку и часть из них стимулировали добавлением форболмиристат-ацетата (Sigma Aldrich, Франция) до концентрации 50 nM, с последующим культивированием при 37 ⁰С в атмосфере  5% CO₂  в течение 3 часов.  Затем в лунки вносили 5 µM Sytox Green (Invitrogen, США). Уровень флюоресценции регистрировали на ридере  TristarTM LB941 BERTHOLD  (Германия): длина волны возбуждения – 485 нм и длина волны излучения – 527 нм [7]. 

Определение миелопероксидазы. Концентрацию миелопероксидазы определяли иммуноферментным методом с помощью набора Human MPO ELISA kit (HycultBiotech, Нидерланды).

Определение цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО-α в сыворотке крови определяли с помощью наборов Вектор Бест (Новосибирск), предназначенных для иммуноферментного анализа.

Статистическая обработка. Результаты в таблице приведены в виде средних величин. Достоверность выявленных различий и величину связей между измеренными параметрами оценивали методами непараметрической статистики с использованием U-критерия Манна-Уитни, Т-критерия Вилкоксона и коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

 

Результаты и обсуждение

При анализе данных, полученных в ходе клинико-лабораторного исследования пациентов с РА и БА, в основу было положено предположение о том, что важными факторами патогенеза этих заболеваний являются изменения баланса хелперов, в значительной степени определяющие специфику клинических проявлений при этих иммунопатологических состояниях. При этом следует ожидать, что интенсивность воспалительных реакций у пациентов с РА, обусловленная преобладанием активности Th1-лимфоцитов, будет более выражена, чем у пациентов с БА, в патогенезе которой доминируют Th2-клетки, и эта картина хорошо согласуется с общим представлением о клинических проявлениях болезни при двух сравниваемых патологиях.

Таблица 1. Уровни внДНК в крови и показатели интенсивности воспалительных процессов у пациентов с ревматоидным артритом и бронхиальной астмой по сравнению с условно-здоровыми донорами

 

Результаты измерения параметров воспалительной активности при РА и БА в момент госпитализации пациентов представлены в Таблице 1. Из нее видно, что, как и предполагалось, основной лабораторный показатель системного воспаления – уровень С-реактивного белка (СРБ) в крови, существенно увеличенный в группе пациентов с РА (среднее значение – 15,97 мг/л при норме до 5 мг/л), оказался почти не измененным при БА (среднее значение – 5,28 мг/л). Кроме того, из трех измеренных у больных с БА провоспалительных цитокинов только для ФНОα было обнаружено значимое повышение уровня в крови, в то время как изменения уровней ИЛ-1 и ИЛ-8 были статистически недостоверны (данные приведены в работе [2]. Эти результаты также можно расценивать как свидетельство отсутствия выраженной системной воспалительной реакции у большинства обследованных пациентов с БА.

Индекс N/L (т.е. соотношение «нейтрофилы/лимфоциты» в периферической крови), который в последнее время всё чаще используется при клинических исследованиях различных заболеваний как весьма чувствительный к динамике воспалительных реакций показатель, оказался в данном случае малоинформативным. Его среднее значение у пациентов с РА (N/L = 2, 59) был даже ниже, чем у пациентов с БА (N/L = 4, 57), но различия между сравниваемыми группами больных были статистически недостоверны (р = 0,33) за счет выраженного разброса значений этого показателя у индивидуальных больных в этих группах. Наиболее вероятной причиной этого явления следует считать неоднородность исследуемых нозологических категорий. Так у пациентов с экзогенной формой БА среднее значение индекса N/L равнялось 2,65, в то время как при эндогенной форме этого заболевания (наиболее тесно связанной с воспалительным процессом в бронхах) оно достигало 5,32. Сходный разброс значений этого индекса наблюдался и в группе пациентов с РА (от 0,70 до 5,14). Таким образом, полученные результаты не дают возможности, ориентируясь на данный показатель, делать какие-либо выводы об активности системного воспаления при сравнении РА и БА.

Несколько иначе обстоит дело с показателями, которые характеризуют активность нейтрофильных лейкоцитов, играющих важную роль в развитии воспалительных реакций в организме. Как видно из таблицы, состояние этих клеток существенно изменено (по сравнению с донорами) как в группе пациентов с РА, так и в группе больных с БА. Несмотря на то, что в условиях in vitro нейтрофилы из крови больных не проявляют повышенной интенсивности спонтанного нетоза (увеличение этого показателя в группе с РА хотя и статистически достоверно, но очень невелико – он повышен лишь на 3% по сравнению с контрольной группой), их способность отвечать реакцией нетоза на внешнюю стимуляцию резко повышена как у больных с РА, так и с БА. Эти результаты неоспоримо свидетельствуют об исходной примированности этих клеток при обеих исследованных патологиях и их повышенной готовности отвечать активацией в ответ на воспалительные стимулы. Не менее существенным представляется и тот факт, что в крови больных как с РА, так и с БА, обнаружено значимое увеличение содержания миелопероксидазы (все данные представлены в работах [1 и 2]). Поскольку этот фермент строго специфичен для нейтрофильных лейкоцитов, повышение его количеств в крови обследованных больных прямо свидетельствует о существенной активации у них процессов нетоза in vivo. Таким образом, лабораторные показатели подтверждают наличие локального воспаления у пациентов с БА при отсутствии явных симптомов системной воспалительной реакции, в то время как у пациентов с РА воспалительные изменения в суставах сопровождаются повышением уровня СРБ, указывающим на системную реакцию организма в ответ на воспалительные стимулы.

 Существенным различием между изучаемыми иммунопатологическими состояниями является обнаруженное в наших исследованиях (Табл.1) существенное снижение уровня внДНК в плазме крови у пациентов с БА, что резко контрастирует с его повышением при РА. Поведение этого показателя в клинике аллергических заболеваний еще недостаточно изучено, и в литературе удалось найти только два сообщения о непосредственном измерении внДНК в крови при БА [12, 15], не совпадающие с результатами нашего исследования. В одной из этих работ не было обнаружено изменений содержания внДНК в крови при БА по сравнению со здоровыми лицами [12], в то время как в работе Varricchi et al. описано некоторое увеличение (на 5 – 10% по сравнению с контролем) данного параметра у пациентов с БА [15]. Однако этот вывод об увеличении количества внДНК в крови больных вызывает определенные сомнения, поскольку указанный в цитируемой работе уровень внДНК у здоровых лиц (2,2 мкг/мл) более чем на два порядка превышает аналогичные данные в статьях, опубликованных другими авторами. Учитывая неоднородность исследуемых групп больных с диагнозом БА, которые представляют собой объединенных в общую нозологическую категорию пациентов с этиологически и патогенетически различными вариантами заболевания, чьи характеристики могут зависеть от случайного распределения больных в конкретной группе, следует, вероятно, считать на сегодняшний день вопрос об уровне внДНК в крови пациентов с БА еще окончательно не  проясненным и требующим дополнительного изучения и проверки.

Тем не менее, полученные в нашем исследовании результаты позволяют с большой степенью уверенности предполагать, что наблюдаемые при БА изменения уровня внДНК в плазме крови не могут объясняться – в отличие от поведения этого показателя при РА – активностью воспалительных реакций при этом заболевании.

Во-первых, при разделении всех обследованных пациентов с БА на три клинически выделяемые фенотипические формы было установлено, что уровень внДНК в этих подгруппах больных был практически одинаков (все данные, характеризующие выделенные подгруппы приведены в работе [2]). При этом в подгруппе пациентов с экзогенной формой БА (наиболее тесно связанной с активностью Th2-зависимых иммунных реакций) величина показателей воспалительной активности – СРБ, N/L, ФНОа, ИЛ-1 и ИЛ-8 – была минимальной, в то время как в подгруппе с эндогенной формой БА (определяемой, в основном, хроническим воспалительным процессом в дыхательных путях) величина этих показателей была максимальной и намного превышала значения аналогичных параметров при экзогенной форме БА.

Во-вторых, к сходным выводам ведут и результаты корреляционного анализа полученных данных. При исследовании пациентов с РА была обнаружена небольшая, но статистически достоверная корреляция уровня внДНК в плазме крови с показателями воспалительной активности: с уровнем СРБ (ρ = +0,270; p < 0,05)  и с  клинически определяемой оценкой степени воспалительной активности в пораженных суставах DAS-28 (ρ = +0,319; p < 0,05). Кроме того, уровни внДНК при РА достаточно тесно связаны с содержанием в крови миелопероксидазы (параметром, отражающим интенсивность нетоза in vivo): ρ = +0,412 (p <0,05). Совершенно иначе выглядят результаты корреляционного анализа данных, полученных при обследовании пациентов с БА: уровень внДНК в плазме крови у индивидуальных больных не коррелирует ни с одним из измеренных провоспалительных цитокинов, ни с СРБ, ни с уровнем миелопероксидазы в крови (коэффициенты ранговой корреляции для этих параметров близки к нулю и статистически не достоверны).

Следовательно, нет достаточных оснований предполагать, что при БА интенсивность воспалительных процессов может оказаться одним из факторов, активно влияющих на содержание внДНК в плазме крови больных. Результаты нашего исследования свидетельствуют скорее о том, что в этом случае уровень внДНК определяется некими иными – еще не известными нам сегодня – патофизиологическими процессами, и механизм регуляции этого параметра не связан напрямую с выраженностью системного или местного воспаления.

Исходя из подобных взглядов, кажется разумным предполагать, что, несмотря на существенное различие между уровнями внДНК в крови при РА и БА, ее продукция и дальнейшая судьба в организме определяется при обеих этих патологиях весьма схожими патофизиологическими процессами.   

Таким образом, следует отметить, что среди результатов проведенного исследования наибольшее внимание привлекает заметное снижение уровня внДНК в плазме крови, выявленное у пациентов с БА. В литературе удалось обнаружить лишь сообщение о некотором уменьшении этого параметра (по сравнению с контролем) у лиц, подвергавшихся хроническому воздействию ионизирующей радиации [6], но не встречаются данные о подобной динамике внДНК при каких-либо заболеваниях и патологических состояниях у человека и животных. В связи с этим несомненный интерес представляют вопросы о том, каковы могут быть физиологические механизмы, способные приводить к возникновению подобных эффектов, и какое патогенетическое и диагностическое значение может иметь падение содержания внДНК в крови больных ниже уровня, определяемого у здоровых индивидов.

Хотя сам факт понижения уровня внДНК у пациентов с БА требует, как уже отмечалось ранее, проверки и дальнейшего изучения, всё же уже сегодня мы можем высказать некоторые гипотетические предположения о причинах подобных изменений указанного параметра при БА.

Во-первых, имеет смысл проверить возможность влияния на содержание внДНК в крови той специфической терапии, воздействию которой подвергаются больные БА. Все участвовавшие в проведенном исследовании пациенты с БА получали на постоянной основе небольшие дозы глюкокортикоидных препаратов, вводимых в виде спрея в дыхательные пути, так что нельзя полностью исключить влияние этих лекарств на измеряемые параметры. Поскольку кортизол способен увеличивать значение индекса N/L [16], то обнаруженные у больных с БА довольно высокие значении этого индекса (несмотря на отсутствие у них симптомов выраженного системного воспаления) можно расценить как дополнительный – хотя и не слишком весомый – аргумент в пользу возможности такого влияния гормонов на характеристики больных при терапии БА. К сожалению, в литературе – наряду с большим количеством работ о повышении внДНК при воспалительных процессах различного генеза – отсутствуют данные, отвечающие на вопрос о возможности снижения ее уровня в крови вследствие терапии глюкокортикоидными гормонами и другими противовоспалительными препаратами. Таким образом, одним из значимых результатов сравнительного исследования количества внДНК в крови пациентов с РА и БА, надо назвать вывод о настоятельной необходимости экспериментального изучения эффектов некоторых гормонов и лекарств с противовоспалительной активностью в отношении обсуждаемого параметра.

 

Заключение

Можно предположить – на правах гипотезы, имеющей право на существование, но сегодня еще не подкрепленной фактами – что состояние Th1/Th2-баланса представляет собой один из значимых регуляторов, определяющих концентрацию внДНК в крови. Сдвиг данного соотношения в сторону преобладания Th1-клеток должен, согласно предлагаемой гипотезе, способствовать развитию воспалительных процессов в организме и увеличивать количество внДНК, в то время как сдвиг баланса хелперов в сторону доминирования Th2-лимфоцитов должен подавлять эти процессы и приводить к снижению внДНК в крови. Однако для проверки данного предположения требуются серьезные экспериментальные исследования на лабораторных моделях иммунопатологических процессов.

 

Исследование выполнено за счет средств федерального бюджета для выполнения государственного задания на научно-исследовательскую работу «Изучение иммунопатогенеза фенотипов социально значимых заболеваний человека и полиморбидности как основа для разработки новых методов персонифицированной диагностики и лечения» (РК №122012000366-9).

 

About the authors

Nikolay N Volskiy

Federal State Budgetary Scientific Institution "Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology" (RIFСI)

Email: dtheory@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9341-1997
Scopus Author ID: 6507873200

PhD, Candidate of Medical Sciences, Leading Researcher, Laboratory of Experimental Immunotherapy

Russian Federation, 630099, г.Новосибирск, ул. Ядринцевская 14

Elena N. Demchenko

Federal State Budgetary Scientific Institution "Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology" (RIFСI), Novosibirsk, Russia

Email: elena.demchenko@gmail.com
ORCID iD: 0009-0001-5178-5616

PhD, Candidate of Chemical Sciences, Researcher,  Laboratory of Experimental Immunotherapy

Russian Federation, 630099, г.Новосибирск, ул. Ядринцевская 14.

Elena V. Goiman

GFederal State Budgetary Scientific Institution "Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology" (RIFСI), Novosibirsk, Russia

Email: l.goiman@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6443-6917
Scopus Author ID: 9845063100

PhD, Candidate of Medical Sciences, Researcher, Laboratory of Experimental Immunotherapy

Russian Federation, 630099, г.Новосибирск, ул. Ядринцевская 14

Vladimir A. Kozlov

Federal State Budgetary Scientific Institution "Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology" (RIFСI), Novosibirsk, Russia

Email: vakoz40@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1756-1782
Scopus Author ID: 7402207410
ResearcherId: K-2634-2014

Academician of RAS., Prof., Scientific Director of the Institute

Russian Federation, 630099, г.Новосибирск, ул. Ядринцевская 14

Elena D. Gavrilova

Federal State Budgetary Scientific Institution "Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology" (RIFСI), Novosibirsk, Russia

Author for correspondence.
Email: edav.gavr@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2014-3397
Scopus Author ID: 36241822400
ResearcherId: AAE-867502929

PhD, Candidate of Biological Sciences, Head of the Laboratory of Experimental Immunotherapy

Russian Federation, 630099, г.Новосибирск, ул. Ядринцевская 14.

References

Supplementary files