Features of the respiratory burst state of neutrophils and the activity of NAD(P)-dependent dehydrogenases in patients with widespread purulent peritonitis in the prognosis of the development of sepsis

Full Text

Введение

Несмотря на достижения в медицине, летальность при распространенном гнойном перитоните (РГП), являющаяся главным критерием оценки эффективности применяемых способов лечения, удерживается на уровне 20-30 %, а в случае генерализации инфекции и развития полиорганной недостаточности и сепсиса достигает 75,8-100 % [1-3]. Само течение РГП, а также характер и особенности развития гнойных инфекционных осложнений определяются не только тяжестью основного патологического процесса, адекватностью оперативного вмешательства и медикаментозного лечения в послеоперационном периоде, но и зависят от происходящих изменений в системе иммунитета [4-6].

Нейтрофильные гранулоциты являются высокореактивными клетками врожденного иммунитета. Они быстро мобилизуются в очаг воспаления, от их фагоцитарной активности во многом зависит эффективность противомикробной защиты организма [7-9]. Обладая широким набором рецепторов, нейтрофилы очень чувствительны к окружающей среде и при малейшем нарушении гомеостаза модулируют свои функции, направленные на его восстановление. Одним из важных аспектов проявления функциональной активности нейтрофилов является респираторный взрыв, развивающийся при взаимодействии клеток с объектами фагоцитоза, интенсивность которого формируется синтезом активных форм кислорода (АФК) [10-12].

Учитывая, что все регуляторные и антигенные молекулы реализуют свое воздействие на клетку через рецепторы, влияя на экспрессию генов, модулируя энергетические и пластические реакции, функциональные проявления нейтрофилов не могут не иметь метаболической основы. В частности, в исследовании J. Gamara et al. (2021) показано, что снижение интенсивности субстратного потока по гликолизу вызывало понижение уровня синтеза АФК нейтрофилами и нарушение активности фагоцитоза [13]. Установлено, что от активности энергетического метаболизма зависит уровень формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек (neutrophil extracellular traps, NET) [14]. Ранее в наших исследованиях было показано, что метаболизм нейтрофилов, выделенных из мокроты больных пневмонией, характеризуется повышением перекисных процессов, снижением терминальных реакций анаэробного гликолиза и оттоком субстратов с цикла трикарбоновых кислот на реакции аминокислотного обмена, сопровождающееся низким уровнем респираторного взрыва [15]. У больных острым деструктивным панкреатитом уровень синтеза NADPH в нейтрофилах крови осуществляется преимущественно за счет активности малик-фермента и NADPH-зависимой глутаматдегидрогеназы, что сопровождается нарушениями синтеза первичных АФК и высоким уровнем синтеза вторичных АФК [7].

РГП сопровождается избыточным поступлением в биологические среды организма микробных антигенов и бактериальных токсинов, источниками которых являются гнойно-деструктивные очаги в брюшной полости, перитонеальный экссудат и паралитически измененные петли кишечника [2, 5]. В связи с этим активность внутриклеточных ферментов в нейтрофилах будет, с одной стороны, определять уровень их реактивности, с другой стороны, модулироваться нарушениями гомеостаза, развивающимися при инфекционно-воспалительном процессе. Можно предположить, что нарушение в метаболизме нейтрофилов при РГП может повысить риск развития сепсиса.

Таким образом, целью исследования явилось изучение особенностей состояния респираторного взрыва и уровней активности NAD(P)-зависимых дегидрогеназ нейтрофилов крови в прогнозе развития абдоминального сепсиса у больных РГП.

В качестве показателей внутриклеточного метаболизма выбраны NAD(P)-зависимые дегидрогеназы в связи с тем, что, во-первых, основными переносчиками электронов в клетках являются пиридиновые нуклеотиды, а отсюда – активное участие оксидоредуктаз в биоэнергетических процессах; во-вторых, NAD(P)-зависимые дегидрогеназы, участвуя в направленной координации сопряженных метаболических потоков, в значительной степени обуславливают адаптивные изменения клеточного обмена веществ [15-17].

Материалы и методы

При проведении ретроспективного исследования было обследовано 50 больных РГП (22 мужчины и 28 женщин) внебольничного и госпитального происхождения в дооперационном периоде, проходивших лечение в отделении гнойной хирургии и отделении реанимации и интенсивной терапии КГБУЗ «КМКБСМП имени Н.С. Карповича» г. Красноярска. Средний возраст больных составил 54,2±19,2 года. Из исследования были исключены больные, у которых РГП был осложнением панкреонекроза, неоперабельных онкологических заболеваний органов брюшной области и неоперабельного нарушения мезентериального кровообращения. Исходную степень тяжести больных определяли по шкале SAPSII [18]. Тяжесть РГП исходно определяли по Мангеймскому индексу перитонита и индексу брюшной полости [19]. Наличие и степень выраженности полиорганной недостаточности исходно и в динамике определяли по шкале SOFA [20]. При оценке тяжести синдрома системной воспалительной реакции мы придерживались критериев ACCP/SCCM [21]. Забор крови для проведения исследования осуществляли в 1-е сутки госпитализации. С 5-х по 10-е сутки послеоперационного периода у 35 больных (70,0 %) развился абдоминальный сепсис, у 15 больных (30,0 %) осложнения отсутствовали. В качестве контроля обследовано 67 здоровых людей аналогичного возрастного диапазона.

Нейтрофильные гранулоциты выделяли из цельной гепаринизированной крови центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-урографина: ρ = 1,077 г/см³ – для отделения лимфоцитов, ρ = 1,119 г/см³ – для выделения нейтрофилов. Состояние респираторного взрыва нейтрофильных гранулоцитов исследовали с помощью хемилюминесцентного анализа [22]. Реакционная смесь для хемилюминесцентной реакции состояла из 20 мкл донорской сыворотки AB(IV)Rh(-), 50 мкл люцигенина или люминола (Sigma, США) в концентрации 10-5 М, 40 мкл опсонизированного зимозана (в случае определения индуцированной хемилюминесценции), 200 мкл взвеси нейтрофилов (2 млн/мл) и 240 мкл раствора Хэнкса («ПанЭко», Россия) для определения спонтанной хемилюминесценции или 200 мкл раствора Хенкса – для индуцированной. Выбор двух хемилюминесцентных индикаторов определяется необходимостью выделения в общем пуле активных форм кислорода (оценивается с помощью люминола) объема синтеза супероксид-радикала (определяется с помощью люцигенина). Оценку спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесценции осуществляли в течение 90 минут на 36-канальном хемилюминесцентном анализаторе «БЛМ-3607» (ООО «МедБиоТех», Красноярск, Россия). Определяли следующие характеристики: время выхода на максимум (Тmax), максимальное значение интенсивности (Imax), а также площадь под кривой (S) хемилюминесценции. Усиление хемилюминесценции, индуцированной зимозаном, оценивали отношением площади индуцированной хемилюминесценции (Sинд.) к площади спонтанной (Sспонт.) и определяли как индекс активации (Sинд./Sспонт.).

Исследование активности NAD(P)-зависимых дегидрогеназ в нейтрофилах крови проведено с помощью биолюминесцентного анализа [23]. Метаболизм нейтрофилов оценивали по активности следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), NADP-зависимой декарбоксилирующей малатдегидрогеназы (NADP-МДГ), NAD- и NADH-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и NADH-ЛДГ), NAD- и NADH-зависимой реакции малатдегидрогеназы (МДГ и NADH-МДГ), NADP- и NADPH-зависимой глутаматдегидрогеназы (NADP-ГДГ и NADPH-ГДГ), NAD- и NADH-зависимой глутаматдегидрогеназы (NAD-ГДГ и NADH-ГДГ), NAD- и NADP-зависимых изоцитратдегидрогеназ (NAD-ИЦДГ и NADP-ИЦДГ, соответственно) и глутатионредуктазы (ГР). Активность NAD(P)-зависимых дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах на 104 клеток, где 1 Е = 1 мкмоль/мин. Исследование проводили на ферментативном препарате NАD(Р):FMNоксидоредуктаза-люцифераза из Photobacterium leiognathi (получен в Институте биофизики СО РАН, Красноярск).

Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.

Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартального размаха в виде 25 и 75 процентилей (С25 и С75). Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни. Для исследования силы взаимосвязей показателей вычислялся коэффициент ранговой корреляции по Спирмену. Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., 2007).

Результаты и обсуждение

При исследовании люцигенин-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов крови обнаружено, что независимо от развития абдоминального сепсиса при РГП уменьшено время выхода на максимум спонтанной хемилюминесценции (табл. 1). При этом только у больных, у которых не будет сепсиса, повышен максимум интенсивности спонтанной люцигенин-зависимой хемилюминесценции относительно контрольных значений и выявленных у лиц с последующим осложнением. Независимо от развития осложнения у больных РГП повышен максимум интенсивности, но снижена площадь под кривой зимозан-индуцированной хемилюминесценции нейтрофилов. Только у больных с отсутствием в послеоперационном периоде сепсиса снижен индекс активации люцигенин-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов крови относительно контрольного уровня и значений, выявленных у пациентов с последующим развитием сепсиса.

 

Таблица 1. Хемилюминесцентная активность нейтрофильных гранулоцитов у больных РГП в прогнозе развития сепсиса (Ме, С25-С75)

Показатели	Контроль n = 67 1		Без последующего развития сепсиса n = 15 2		С последующим развитием сепсиса n = 35 3
	Ме	С25-С75	Ме	С25-С75	Ме	С25-С75
Спонтанная люцигенин-зависимая хемилюминесценция
Tmax, сек.	2718	2010-3791	1651	1193-2606	2028	1136-2531
			p1 = 0,010		p1 = 0,001
Imax, о.е. × 103	5,68	2,55-14,06	42,07	10,07-76,31	13,47	2,23-31,85
			p1 = 0,002		p2 = 0,043
S, о.е.ґ	2,28	0,96-5,85	2,20	1,34-7,84	1,81	0,17-4,34
Зимозан-индуцированная люцигенин-зависимая хемилюминесценция
Tmax, сек.	2064	1676-2722	2020	1401-2186	2172	1008-2550
Imax, о.е. × 103	12,87	7,83-27,64	25,91	17,10-47,40	22,98	9,13-35,90
			p1 = 0,031		p1= 0,026
S, о.е.ґ	4,53	2,52-8,22	2,49	1,41-4,44	2,80	1,20-6,28
			p1 = 0,048		p1 = 0,049
Sинд./ Sспонт.	2,04	1,20-3,60	1,04	0,34-1,77	1,78	1,20-6,28
			p1 = 0,031		p2 = 0,041
Спонтанная люминол-зависимая хемилюминесценция
Tmax, сек.	1003	609-1574	1097	863-1168	1138	895-1373
Imax, о.е. × 103	8,68	3,81-23,08	26,71	12,38-37,48	31,92	18,17-46,61
			p1 = 0,015		p1 < 0,001 p2 = 0,049
S, о.е.ґ	2,70	1,13-7,55	2,45	0,56-3,29	3,41	1,94-7,00
Зимозан-индуцированная люминол-зависимая хемилюминесценция
Tmax, сек.	1117	805-1489	1052	955-1348	1009	708-1377
Imax, о.е. × 103	17,93	7,02-36,56	34,56	18,45-76,75	66,78	47,07-107,81
			p1 = 0,007		p1 < 0,001
S, о.е.ґ	5,74	1,97-11,20	6,76	1,60-9,10	8,60	4,10-11,30
					p1 = 0,029
Sинд./ Sспонт.	1,72	1,33-2,53	2,75	1,63-5,34	2,24	1,50-3,43
			p1 = 0,026		p1 = 0,043

Примечание: p₁ – статистически значимые различия с показателями контрольной группы; p₂ – статистически значимые различия с показателями больных РГП, у которых не будет сепсиса.

 

Известно, что люцигенин окисляется и люминесцирует только под влиянием супероксид-радикала, который определяется как первичная АФК и синтезируется в системе NADPH-оксидазы [10, 24]. В то же время бактерицидная активность нейтрофилов также определяется и уровнем синтеза вторичных форм кислорода [22, 25]. Для оценки суммарного уровня синтеза и первичных, и вторичных АФК мы определяли показатели люминол-зависимой хемилюминесценции.

Обнаружено, что максимум интенсивности люминол-зависимой спонтанной хемилюминесценции нейтрофилов при РГП повышен относительно контрольных значений (см. табл. 1). При этом у больных с отсутствием осложнений послеоперационного периода максимум интенсивности данной кривой выше, чем у пациентов, у которых развивается сепсис. Максимум интенсивности зимозан-индуцированной и индекс активации люминол-зависимой хемилюминесценции повышен у больных РГП относительно контрольных значений независимо от развития осложнений в послеоперационном периоде. В то же время площадь под кривой люминол-зависимой индуцированной хемилюминесценции нейтрофилов повышена только у больных, у которых в послеоперационном периоде развивается абдоминальный сепсис.

При исследовании активности NAD- и NADP-зависимых дегидрогеназ в нейтрофилах крови обнаружено, что независимо от развития абдоминального сепсиса при РГП относительно контрольных значений снижается активность Г6ФДГ, ЛДГ и NADP-ГДГ (табл. 2). Также независимо от последующего развития сепсиса у больных РГП в нейтрофилах повышается активность NADP-ИЦДГ, NADH-ЛДГ и NADH-МДГ. Однако у пациентов с последующим развитием сепсиса внутриклеточная активность NADH-ЛДГ ниже, чем у пациентов без последующего развития сепсиса. У больных РГП без последующего развития сепсиса в нейтрофилах понижена активность NADP-МДГ как относительного диапазона, так и выявленного у пациентов с последующим развитием сепсиса. У больных РГП с последующим развитием сепсиса в нейтрофилах повышена активность NADPH-ГДГ как относительно контрольного уровня, так и значений, выявленных у пациентов без последующего развития сепсиса.

 

Таблица 2. Активность NAD- и NADP-зависимых дегидрогеназ в нейтрофилах крови у больных РГП в прогнозе развития сепсиса (Ме, С25-С75)

Показатели	Контроль n = 67 1		Без последующего развития сепсиса n = 15 2		С последующим развитием сепсиса n = 35 3
	Ме	С25-С75	Ме	С25-С75	Ме	С25-С75
Г6ФДГ	0,86	0,12-4,16	0,01	0,005-0,30	0,04	0,01-0,58
			р1 < 0,001		р1 < 0,001
Г3ФДГ	0,54	0,07-1,68	0,38	0,08-1,03	0,61	0,30-1,35
ЛДГ	11,45	1,44-43,03	0,01	0,005-1,12	0,01	0,001-0,17
			р1 < 0,001		р1 < 0,001
NADP-МДГ	0,02	0,01-0,77	0,007	0,005-0,01	0,02	0,01-0,14
			р1 = 0,024		р2 = 0,008
NADP-ГДГ	0,12	0,05-0,83	0,02	0,01-0,04	0,02	0,01-0,05
			р1 = 0,019		р1 = 0,004
NADP-ИЦДГ	1,18	0,18-2,79	5,39	0,55-10,13	7,95	2,16-16,22
			р1 = 0,039		р1 = 0,002
МДГ	4,01	0,85-10,31	4,48	0,74-13,10	8,51	0,96-18,61
NAD-ГДГ	0,53	0,12-1,42	0,46	0,13-1,08	0,42	0,18-1,36
NAD-ИЦДГ	0,05	0,01-1,85	3,40	0,01-7,64	4,92	1,57-6,79
			р1 = 0,009		р1 < 0,001
NADH-ЛДГ	0,24	0,10-10,23	18,32	2,15-70,01	3,98	1,05-23,40
			р1 = 0,010		р1 = 0,025 р2 = 0,018
NADH-МДГ	12,60	2,05-53,34	73,87	35,22-127,13	47,41	12,16-96,33
			р1 < 0,001		р1 = 0,037
ГР	1,02	0,27-3,30	1,15	0,31-2,98	1,04	0,19-2,45
NADH-ГДГ	5,31	1,02-16,39	8,20	2,52-21,03	25,78	8,78-53,67
					р1 = 0,012 р2 = 0,044
NADPH-ГДГ	45,29	7,13-88,71	30,85	11,20-39,59	30,35	8,78-62,48

Примечание: то же, что и для табл. 1.

 

С помощью корреляционного анализа исследована взаимосвязь показателей респираторного взрыва в нейтрофилах и внутриклеточная активность NAD(P)-зависимых дегидрогеназ. Установлено, что у лиц контрольной группы активность ГР нейтрофилов отрицательно взаимосвязана с максимумом интенсивности спонтанной (r = -0,63, р = 0,002) и зимозан-индуцированной (r = -0,75, р < 0,001) люцигенин-зависимой хемилюминесценции, тогда как активность НАДФИЦДГ положительно – с площадью под кривой спонтанной (r = 0,52, р = 0,015) и максимумом интенсивности индуцированной (r = -0,75, р < 0,001) хемилюминесценции. Активность NADP-МДГ нейтрофилов у лиц данной группы положительно коррелирует с максимумом интенсивности и площадью под кривой спонтанной (r = 0,27, р = 0,043 и r = 0,35, р = 0,008 соответственно) и зимозан-индуцированной (r = 0,30, р = 0,028 и r = 0,40, р = 0,003 соответственно) люминол-зависимой хемилюминесценции, также как активность МДГ положительно – с максимумом интенсивности спонтанной (r = 0,38, р = 0,004) и площадью под кривой (r = 0,33, р = 0,013) индуцированной хемилюминесценции.

У больных РГП без последующего развития сепсиса обнаружены взаимосвязи между активностью ГР и максимумом интенсивности спонтанной люцигенин-зависимой хемилюминесценции (r = -0,65, р = 0,040), активностью Г3ФДГ и площадью под кривой данной хемилюминесцентной кривой (r = 0,71, р = 0,022) и активностью NADP-МДГ и площадью под кривой индуцированной хемилюминесценции (r = -0,70, р = 0,024). Кроме того, у пациентов данной группы выявлены положительные корреляции активности Г3ФДГ с максимумом интенсивности спонтанной (r = 0,73, р = 0,025) и площадью под кривой спонтанной (r = 0,88, р = 0,002) и индуцированной (r = 0,80, р = 0,010) люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов, а также отрицательная взаимосвязь между активностью NADP-МДГ и площадью под кривой спонтанной хемилюминесценции (r = -0,73, р = 0,025).

У больных РГП с последующим развитием сепсиса активность NADP-ИЦДГ нейтрофилов отрицательно взаимосвязана с площадью под кривой спонтанной (r = -0,50, р = 0,033) и максимумом интенсивности индуцированной люцигенин-зависимой хемилюминесценции (r = -0,51, р = 0,030), а также выявляется положительная корреляция между активностью ГР и максимумом интенсивности индуцированной хемилюминесценции (r = 0,51, р = 0,043). Кроме того, у пациентов данной группы активность NADP-МДГ отрицательно коррелирует с максимумом интенсивности спонтанной (r = -0,50, р = 0,025) и индуцированной (r = -0,50, р = 0,033) люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов, а активность МДГ также отрицательно – с максимумом интенсивности спонтанной хемилюминесценции (r = -0,57, р = 0,010)

Течение и исход перитонита во многом определяется эффективностью воспалительных процессов и изменениями функциональной активности нейтрофилов как основной популяцией клеток, принимающих участие в процессах воспаления. Респираторный взрыв является важным защитным механизмом, лежащим в основе реактивности данной популяции клеток [10, 12, 22]. Установлено, что у больных РГП, послеоперационный период которых будет протекать без осложнений, уровень спонтанного синтеза первичных АФК нейтрофилами крови выше, чем у здоровых людей и больных с последующим развитием сепсиса. Реакция НАДФН-оксидазы на индукцию респираторного взрыва зимозаном при РГП незначительна, однако при отсутствии развития осложнений основного заболевания выявляется снижение индекса активации. Уровень спонтанного синтеза вторичных АФК нейтрофилами крови у больных без сепсиса в послеоперационном периоде выше, чем у здоровых лиц, но ниже, чем у больных с сепсисом. Индукция синтеза вторичных АФК под воздействием зимозана более выражена у пациентов с РГП, у которых послеоперационный период будет осложнен сепсисом. Между тем необходимо отметить, что бактерицидная активность нейтрофилов в большей степени определяется синтезом первичных АФК [10, 12].

Исследуемые NAD- и NADP-зависимые дегидрогеназы нейтрофилов занимают ключевые позиции на разных метаболических путях клетки, характеризуя основные обменные процессы. Так, Г6ФДГ является ключевым и инициализирующим ферментом пентозофосфатного цикла, от активности которого зависит широкий спектр синтетических процессов [26]. Соответственно, снижение активности фермента в нейтрофилах больных РГП определяет значительную недостаточность реакций пластического обмена. NADP-МДГ также является NADP-зависимым ферментом, локализующимся в цитоплазматическом компартменте нейтрофилов. С его активностью связывают интенсивность реакций липидного анаболизма и катаболизма ксенобиотиков [27]. Обнаружено, что у больных РГП с последующим развитием сепсиса активность фермента значительно снижена, тогда как у пациентов, у которых в процессе лечения развивается данное осложнение, активность NADP-МДГ соответствует контрольному уровню. Также нами исследованы уровни активности NADP-зависимых глутаматдегидрогеназы и изоцитратдегидрогеназы. Активность первого фермента, принимающего участие в процессах внутриклеточного обмена азота, при РГП снижается, активность NADP-ИЦДГ повышается.

NADPH, синтезируемый в данных исследуемых реакциях, может быть использован в широком спектре процессов, включая систему антиоксидантной защиты и респираторный взрыв. Единственным из исследуемых ферментов, принимающим участие в антиоксидантных реакциях, является ГР [28]. Однако активность данного фермента в нейтрофилах больных РГП соответствует контрольным значениям. С помощью корреляционного анализа мы оценили влияние активности NADP-зависимых дегидрогеназ на интенсивность респираторного взрыва нейтрофилов. Установлено, что у здоровых людей в нейтрофилах крови активность NADPH-оксидазы (определяющая состояние люцигенин-зависимой хемилюминесценции за счет синтеза супероксид-радикала) положительно взаимосвязана с активностью NADP-ИЦДГ и отрицательно – с ГР. Уровень синтеза вторичных АФК в нейтрофилах у лиц данной группы положительно коррелирует с активностью NADP-МДГ. Выявленные корреляционные связи характеризуют стимулирующее влияние ферментов, синтезирующих NADPH, на состояние респираторного взрыва. Отрицательная корреляционная связь между активностями NADPH-оксидазы и ГР отражает, по-видимому, конкурентные взаимосвязи между ферментами, окисляющими NADPH. У больных РГП без последующего развития сепсиса уровень синтеза первичных и вторичных АФК нейтрофилами только отрицательно взаимосвязан с активностью ГР и NADP-МДГ. И если в первом случае отрицательную взаимосвязь также можно рассматривать в качестве наличия конкурентных взаимоотношений за кофермент, то во втором случае инверсия (по сравнению с выявленной у здоровых людей) корреляционной связи отражает нарушения в метаболических механизмах поддержания респираторного взрыва в нейтрофилах. В то же время, исходя из особенностей корреляционных связей, у больных РГП с последующим развитием сепсиса в нейтрофилах крови выявляются еще большие нарушения в метаболических механизмах поддержания респираторного взрыва. Так, у пациентов данной группы с уровнем синтеза первичных и вторичных АФК положительно взаимосвязана активность ГР и отрицательно – NADP-МДГ и NADP-ИЦДГ. Данные взаимосвязи отражают отсутствие конкурентных взаимодействий активности NADPH-оксидазы с активностью ГР, но их появление – с уровнями активности NADPH-синтезирующих ферментов.

Так как пентозофосфатный цикл является конкурентом гликолизу за субстрат, можно предположить, что при снижении активности Г6ФДГ интенсивность субстратного потока по гликолизу возрастет. Действительно, у больных РГП в нейтрофилах активность анаэробной реакции ЛДГ (NADH-ЛДГ) повышается относительно контрольных значений, причем у пациентов без последующего развития сепсиса ее активность значительно выше, чем у пациентов с последующим развитием сепсиса. Подобные изменения интенсивности анаэробного гликолиза, безусловно, повлияют на энергетическое состояние клеток. Следовательно, у больных РГП, послеоперационный период которых пройдет без осложнений, наработка ATP в гликолизе более выражена, чем у пациентов с последующим развитием сепсиса. Причем известно, что изменение функциональной активности нейтрофилов происходит при повышении интенсивности субстратного потока по гликолизу [22, 29].

Нейтрофилы являются клетками, осуществляющими свою функцию преимущественно в анаэробных условиях. Однако их метаболизм также зависит от состояния обменных процессов в митохондриях [30]. Обнаружено, что активность NAD-ИЦДГ в нейтрофилах крови у больных РГП повышена независимо от наличия/отсуствия последующих осложнений. Фермент является лимитирующим интенсивность субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот, который в значительной степени определяет активность аэробного дыхания [31]. Однако активность МДГ (другой фермент лимонного цикла) в нейтрофилах больных не изменена. Кроме того, у обследованных пациентов обнаружено повышение активности NADH-зависимой реакции МДГ, которая является ключевой в системе малат-аспартатного шунта митохондрий [32]. Подобный дисбаланс может значительно снизить энергетические возможности клеток и, безусловно, повлиять на их функциональную активность.

Цикл трикарбоновых кислот является анаплеротическим, соединяющим все основные метаболические процессы в клетке. В связи с этим можно предположить, что снижение интенсивности субстратного потока в промежутке между NAD-ИЦДГ и МДГ связано с выведением субстратов с лимонного цикла. Данная особенность зафиксирована в нейтрофилах у больных РГП с последующим развитием сепсиса. Обнаружено, что в клетках у лиц данной группы значительно повышается активность NADH-ГДГ, что отражает отток субстратов с лимонного цикла на реакции аминокислотного обмена.

Как уже отмечалось, функциональная активность нейтрофилов зависит от их энергетического статуса. В связи с этим мы исследовали особенности взаимосвязи между показателями респираторного взрыва нейтрофилов и уровнями активности NAD-зависимых дегидрогеназ. Обнаружено, что если у здоровых людей активность МДГ положительно взаимосвязана с синтезом вторичных АФК, то у больных РГП без последующего развития сепсиса с уровнем синтеза первичных и вторичных также положительно взаимосвязана активность Г3ФДГ. Данный фермент за счет продуктов липидного катаболизма осуществляет субстратную стимуляцию гликолиза [33]. Можно предположить, что данный механизм стимулирует активность анаэробной реакции ЛДГ в нейтрофилах крови у больных без последующих осложнений и определяет высокую интенсивность синтеза АФК. У больных РГП с последующим развитием сепсиса выявлена отрицательная взаимосвязь активности МДГ с уровнем синтеза первичных АФК. Данная взаимосвязь является противоположной по знаку выявленной у здоровых лиц и отражает наличие конкурентных взаимодействий между метаболизмом митохондриального компартмента и активностью NADPH-оксидазы.

Выводы

Таким образом установлено, что у больных РГП увеличивается интенсивность респираторного взрыва нейтрофилов крови за счет активации синтеза как первичных, так и вторичных АФК. У больных РГП, у которых в динамике послеоперационного периода разовьется абдоминальный сепсис, хемилюминесцентная активность нейтрофилов крови характеризуется пониженным уровнем спонтанного синтеза первичных АФК и повышенным уровнем спонтанного синтеза вторичных АФК относительно показателей, выявленных у больных без последующего развития осложнений. Уровни синтеза первичных и вторичных АФК нейтрофилами при индукции респираторного взрыва зимозаном незначительно различаются в группах больных РГП в зависимости от последующего развития сепсиса в послеоперационном периоде. Метаболизм нейтрофилов у больных РГП характеризуется снижением интенсивности пластических процессов за счет низкой активности Г6ФДГ и дисбалансом активности ферментов митохондриального компартмента. Особенностью метаболизма нейтрофилов у больных РГП без последующего развития сепсиса является высокая активность анаэробной реакции ЛДГ и снижение активности NADP-МДГ. У больных РГП с последующим развитием сепсиса обнаружен высокий уровень NAD-зависимого оттока субстратов с цикла трикарбоновых кислот на реакции аминокислотного обмена через глутаматдегидрогеназу, что может повлиять на активность аэробного дыхания нейтрофилов. С помощью корреляционного анализа установлено, что интенсивность респираторного взрыва нейтрофилов у больных без последующего развития осложнений зависит от активности анаэробного гликолиза. У пациентов с последующим развитием сепсиса в нейтрофилах крови выявляются конкурентные взаимосвязи между уровнями синтеза первичных и вторичных АФК и активностью ферментов. Установленные различия в состоянии респираторного взрыва и активности ферментов в нейтрофилах у больных РГП в зависимости от последующего развития сепсиса определяют возможность разработки метода прогноза развития осложнений и разработки иммуноактивной терапии в послеоперационном периоде РГП.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

About the authors

Andrey A. Savchenko

Krasnoyarsk Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences of the «Research Institute of Medical Problems of the North»

Email: 2410454@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5829-672X
SPIN-code: 3132-8260

д.м.н., профессор, заведующий лабораторией клеточно-молекулярной физиологии и патологии 

Russian Federation, Krasnoyarsk

Alexander G. Borisov

Krasnoyarsk Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences of the «Research Institute of Medical Problems of the North»

Author for correspondence.
Email: 2410454@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9026-2615
SPIN-code: 9570-2254

к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клеточно-молекулярной физиологии и патологии 

Russian Federation, Krasnoyarsk

Ivan I. Gvozdev

Krasnoyarsk Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences of the «Research Institute of Medical Problems of the North»

Email: 2410454@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1041-9871
SPIN-code: 6203-4651

младший научный сотрудник лаборатории клеточно-молекулярной физиологии и патологии 

Russian Federation, Krasnoyarsk

References

Supplementary files