Immunoregulatory properties of the dry extract of the herb Cichorium intybus L. in in vitro and in vivo systems

Full Text

Введение

В течение последних десятилетий возрастает интерес исследователей к безопасным иммунорегуляторным средствам, нормализующим параметры иммунной системы. Представляет актуальность поиск растительных источников иммунорегуляторных средств, обладающих рядом преимуществ перед синтетическими: мягким иммуномодулирующим действием, низкой токсичностью, способностью к активации функций не только иммунной, но и нервной, и эндокринной систем благодаря наличию биологически активных веществ (БАВ), оказывающих комплексное воздействие на организм в целом [4, 5]. Перспективным сырьем для разработки иммунорегуляторных средств является трава Cichorium intybus L., накапливающая, в соответствии с данными литературы, большой комплекс БАВ полифенольной природы – флавоноиды (флавоны, флавонолы, изофлавоны, неофлавоноиды, халконы, антоцианидины и проантоцианидины) и не- флавоноиды, такие как гидроксикоричные кислоты, кумарины, фенольные кислоты, стильбеноиды, амиды фенолов, а также сесквитерпеновые лактоны, витамины [12]. Известно, что фенольные соединения растений обладают иммунорегуляторным действием, механизм которого, по данным литературы, может заключаться в иммунокорригирующем действии в условиях цитостатической иммуносупрессии и в регуляции синтеза провоспалительных цитокинов [6]. Иммунорегуляторным свойствам растительных фенолов способствуют их выраженная антиоксидантная активность и способность ингибировать прооксидантные ферменты (ксантиноксидазу, NADPH-оксидазу) и активировать антиоксидантные ферменты (супероксиддисмутазу, каталазу, глутатионпероксидазу) [10]. Можно предположить, что трава Cichorium intybus L. и сухой экстракт из данного сырья, накапливающие наиболее высокие концентрации фенольных соединений, могут быть рассмотрены в качестве перспективных иммунорегуляторных средств. В то же время известно, что содержание фенольных соединений и других БАВ в производящем растении зависит от условий произрастания [1, 7]. По этой причине представляет интерес проведение исследования иммунорегуляторной активности сухого экстракта из травы цикория, заготовленной в оптимальных условиях, способствующих накоплению БАВ. Кроме того, актуальность исследования иммунорегуляторной активности фитопрепаратов цикория обусловливается отсутствием системных сведений об их влиянии на иммунную систему. Недостаточно изучено влияние сырья и фитопрепаратов цикория на продукцию цитокинов периферическими мононуклеарными клетками человека в системе in vitro и на показатели органов иммуногенеза в условиях цитостатической иммуносупрессии, индуцированной метотрексатом (MTX), в системе in vivo. Указанные моменты предопределили направленность наших исследований, которые могли бы способствовать лучшему пониманию аспектов иммунорегуляторного влияния фенольных компонентов растений на примере сухого экстракта травы Cichorium intybus L., а также изысканию новых подходов для дальнейшей работы по разработке эффективных растительных препаратов иммунонаправленного действия.

Цель исследования – оценка влияния сухого экстракта травы Cichorium intybus L. на продукцию цитокинов периферическими мононуклеарными клетками человека в системе in vitro и на массу (тимус, селезенка) и количество клеток (тимус, селезенка, костный мозг) органов иммунной системы мышей в модельном эксперименте иммунодефицита в системе in vivo.

Материалы и методы

Объектом исследования послужил сухой экстракт травы Cichorium intybus L., собранного в Тюльганском районе Оренбургской области. Выбор района заготовки сырья был обусловлен ранее проведенным исследованием по определению содержания БАВ в траве Cichorium intybus L., произрастающего в различных районах Оренбургской области, которое показало, что трава Cichorium intybus L., собранного в Тюльганском районе, характеризуется максимальным содержанием фенольных соединений, ввиду чего обладает наибольшим потенциалом для разработки средств, обладающих иммунорегуляторной активностью [1, 7].

Экспериментальные исследования по определению иммунорегуляторной активности сухого экстракта травы Cichorium intybus L., заготовленного в Тюльганском районе, были выполнены на мононуклеарных клетках периферической крови человека и на 129 половозрелых беспородных белых мышах-самцах массой 25-30 г. Работа с биологическим материалом и животными проводилась в соответствии с этическими нормами и рекомендациями, отраженными в Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, 1998) и приказе МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Изучение иммунорегуляторных свойств сухого экстракта травы цикория, заключающихся в способности изменять продукцию цитокинов, оценивали на модели мононуклеаров периферической крови человека при сокультивировании в системе in vitro [2]. Мононуклеарные лейкоциты выделяли в стерильных условиях из гепаринизированной крови здоровых 10 доноров методом градиентного центрифугирования (400g) в градиенте плотности фиколл-верографин (Pharmacia, Швеция) плотностью 1,077 г/см³. Продукцию цитокинов изучали в культуре мононуклеаров, сокультивируемых c добавлением водного раствора экстракта травы цикория в концентрациях 10, 5 и 2,5 мг/кг (опыт) и без добавления экстракта (контроль) после 24-часовой инкубации клеток (2х10⁶) при 37 ⁰С в атмосфере 5 % СО₂ в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10%-ной инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США) и 80 мкг/мл гентамицина. Через сутки собирали супернатанты и замораживали (-20 0С) для дальнейшего определения в них уровня цитокинов. В супернатантах мононуклеарных лейкоцитов, стимулированных экстрактом цикория, определяли про- (IFN-γ, TNF-α, IL-6) и противовоспалительные (IL-10, IL-1Ra) цитокины методом ИФА (тест-системы «Цитокин», Россия). Регистрацию результатов проводили на фотометре Multiskan (Labsystems, Финляндия). Результат влияния раствора экстракта цикория на мононуклеарные клетки периферической крови человека оценивали по изменению концентрации цитокинов в культуральной среде по сравнению с контролем [2].

Оценку иммуномодулирующей активности сухого экстракта травы цикория в системе in vivo проводили в соответствии с рекомендациями [3] путем установления массы экспериментальных животных, определения в крови числа лейкоцитов, в тимусе и селезенке – массы и количества клеток, в костном мозге (КМ) – количества клеток на модели иммуносупрессии [4], которая создавалась цитостатиком метотрексатом (MTX) («Сандоз», Словения; лекарственная форма – раствор для инъекций). Сухой экстракт цикория и препарат сравнения «Иммунал» мыши получали через 1 ч., затем через 24 ч. и через 48 ч после введения MTX. Экспериментальные мыши были разделены на 12 групп: 1-я группа – интактные мыши, получавшие воду; 2-я группа – мыши, получавшие сухой экстракт цикория в дозировке 50 мг/кг (Эц 50 мг/кг); 3-я группа – мыши, получавшие сухой экстракт цикория в дозировке 100 мг/кг (Эц 100 мг/кг); 4-я группа – мыши, получавшие сухой экстракт цикория в дозировке 200 мг/кг (Эц 200 мг/кг); 5-я группа – мыши, получавшие сухой экстракт цикория в дозировке 400 мг/кг (Эц 400 мг/кг); 6-я группа – мыши, получавшие препарат сравнения «Иммунал» в дозировке 5 мл/кг (Им 5 мл/кг); 7-я группа – мыши, получавшие MTX в дозировке 10 мг/кг; 8-я группа – мыши, получавшие MTX в дозировке 10 мг/кг и сухой экстракт цикория в дозировке 50 мг/кг (MTX 10 мг/кг + Эц 50 мг/кг); 9-я группа – мыши, получавшие MTX в дозировке 10 мг/кг и сухой экстракт цикория в дозировке 100 мг/кг (MTX 10 мг/кг + Эц 100 мг/кг); 10-я группа – мыши, получавшие MTX в дозировке 10 мг/кг и сухой экстракт цикория в дозировке 200 мг/кг (MTX 10 мг/кг + Эц 200 мг/кг); 11-я группа – мыши, получавшие MTX в дозировке 10 мг/кг и сухой экстракт цикория в дозировке 400 мг/кг (MTX 10 мг/кг + Эц 400 мг/кг); 12-я группа – мыши, получавшие MTX в дозировке 10 мг/кг и препарат сравнения «Иммунал» в дозировке 5 мл/кг (MTX 10 мг/кг + Им 50 мг/кг). Все животные выводились из эксперимента на 4-е сутки.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 9.0 (США). Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка. Количественные данные, имеющие нормальное распределение, описывались в виде среднего арифметического и ошибки (M±m). В случае отсутствия нормального распределения количественные показатели описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q_0,25-Q_0,75). Группы сравнивали, применяя непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при p ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение

Анализ влияния растворов сухого экстракта травы цикория на модели мононуклеаров периферической крови человека показал, что растворы сухого экстракта травы цикория подавляли продукцию всех исследуемых цитокинов, за исключением противовоспалительного цитокина IL-10. Концентрация ключевого провоспалительного цитокина TNFα снижалась на три порядка при влиянии раствора экстракта 10,0 мг/мл с 56,9-57,4 пг/мл в контроле до 18,0±0,5 пг/мл в опытных пробах, при влиянии концентрации 5,0 мг/мл выраженность ингибирующего эффекта сохранялась; при влиянии концентраций 2,5 мг/мл отмечалось снижение уровня цитокина в 1,5 раза до 40,1±0,9 пг/мл (р ≤ 0,05). Данное ингибирующее действие растворов экстракта сохранялось и при оценке влияния изучаемых концентраций на продукцию IL-6 лимфоцитами: его концентрация снижалась в 1,8-3,9 раза с 45,6-53,1 пг/мл в контроле до 13,6-22,4 в опытных пробах (р ≤ 0,05). Снижение концентрации IFNγ на фоне применения сухого экстракта травы цикория отмечалось во всех разведениях [10,0; 5,0; 2,5 мг/мл]: 10,0 мг/мл – в 2,6 раза до 43,3±1,0 пг/мл; 5,0 мг/мл – в 3 раза до 36,5±0,5 пг/мл; 2,5 мг/мл – в 3,4 раза до 32,9±0,5 пг/мл (р ≤ 0,05). Концентрация противовоспалительного цитокина IL-1Ra также снижалась под влиянием раствора сухого экстракта травы цикория 10,0 мг/мл в 2,3 раза: от 114,0-118,5 пг/мл в контроле до 53,6±0,4 пг/мл в опытных пробах, при влиянии концентрации 5,0 мг/мл выраженность ингибирующего эффекта сохранялась; при влиянии концентраций 2,5 мг/мл отмечалось снижение уровня цитокина в 2 раза до 60,9±0,6 пг/мл (р ≤ 0,05). Напротив, содержание другого противовоспалительного цитокина IL-10 увеличивалось при добавлении раствора экстракта травы в среду культивирования лимфоцитов (р ≤ 0,05), причем выраженность стимулирующего эффекта раствора экстракта отличалась в зависимости от его концентрации в среде. При добавлении в среду культивирования мононуклеарных клеток раствора экстракта цикория в концентрации 10 мг/мл уровень IL-10 увеличивался в 3 раза до 152,1±8,8 пг/мл, при добавлении меньших концентраций (5-2,5 мг/мл) – только в 1,5-2 раза до 81,5-106,4 пг/мл (р ≤ 0,05).

Таким образом, установлено, что раствор сухого экстракта травы цикория в исследуемых культурах увеличивал концентрацию только противовоспалительного цитокина IL-10 и снижал продукцию провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6, IFNγ и противовоспалительного цитокина IL-1Ra. На основании полученных данных можно предположить, что изученный экстракт может выступать в роли модификатора активности клеток иммунной системы человека.

В целях установления возможной иммуномодулирующей активности экстракта цикория в системе in vivo была проведена оценка влияния экстракта на массу (тимус, селезенка) и количество клеток (тимус, селезенка, костный мозг) органов иммунной системы мышей, находившихся в состоянии иммуносупрессии, индуцированной метотрексатом. Кроме того, было проведено сравнительное изучение влияния раствора экстракта с известным иммуномодулирующим средством на основе эхинацеи «Иммунал».

Исследование влияния сухого экстракта травы Cichorium intybus L. на массу и клеточность органов иммунной системы мышей установило, что применение экстракта цикория, «Иммунала» и МТХ в указанных дозировках не сопровождалось гибелью экспериментальных животных. Было показано, что экстракт цикория в дозировках 50, 100 и 200 мг/кг и препарат сравнения «Иммунал» не оказывали влияния на количество клеток тимуса, селезенки и костного мозга мышей. В дозировке экстракта 400 мг/кг было отмечено достоверное снижение числа лейкоцитов, что может свидетельствовать о незначительном иммуносупрессивном действии высоких доз экстракта (табл. 1). Анализ влияния MTX на количество клеток тимуса, селезенки и костного мозга мышей установил (табл. 1), что введение препарата приводило к достоверному снижению числа лейкоцитов, массы тимуса и числа тимоцитов по сравнению с теми же показателями в группе интактных мышей, в то время как масса селезенки, число спленоцитов и число миелокариоцитов мышей, получавших MTX, были существенно не изменены по сравнению с аналогичными показателями интактных мышей. Анализ влияния экстракта цикория на показатели иммунной системы беспородных мышей в условиях иммуносупрессии выявил, что экстракт цикория в дозировке 50, 100 и 400 мг/кг восстанавливал параметры иммунной системы беспородных мышей в условиях иммуносупрессии, индуцированной MTX, до уровня показателей интактных мышей. При введении на фоне иммуносупрессии сухого экстракта травы Cichorium intybus L. в дозировке 50 мг/кг наблюдалось достоверное увеличение числа тимоцитов, в дозировке 100 мг/кг – числа лейкоцитов, в дозировке 400 мг/кг – массы тимуса в сравнении с аналогичными показателями мышей, получавших MTX. Следует отметить, что не выявлено достоверных различий между количеством клеток тимуса, селезенки, костного мозга мышей, получавших сухой экстракт травы цикория на фоне иммуносупрессии, и животных, получавших «Иммунал» на фоне MTX, в связи с чем можно сделать вывод о том, что действие сухого экстракта травы Cichorium intybus L. сопоставимо с эффектом препарата сравнения «Иммунал» (табл. 1).

 

Таблица 1. Влияние сухого экстракта Cichorium intybus L. на массу и клеточность органов иммунной системы мышей

Группа	Масса мыши, г	Чисто лейкоцитов, ×109	Масса тимуса, мг	Число тимоцитов, ×106/орган	Масса селезенки, мг	Число спленоцитов, ×106/орган	Число миелокариоцитов, ×106/орган
Группа 1: интактные мыши (n = 14)	29 [26; 31]	7,3 [6, 1; 8, 1]	26 [24; 30]	38 [29; 44]	136 [111; 170]	173 [99; 207]	11 [9; 12]
Группа 2: Эц 50 мг/кг (n = 10)	28 [28; 28]	5,7 [5, 7; 8, 6]	24 [21; 28]	21 [20; 29]	135 [127; 150]	185 [180; 192]	10 [8; 13]
Группа 3: Эц 100 мг/кг (n = 10)	28 [28; 29]	6,8 [6, 4; 7, 9]	23 [19; 29]	41 [29; 49]	118 [115; 140]	128 [120; 257]	9 [8; 9]
Группа 4: Эц 200 мг/кг (n = 10)	30 [29; 30]	4,9 [4, 6; 9, 8]	30 [27; 38]	36 [36; 58]	135 [132; 160]	141 [135; 161]	8 [8; 9]
Группа 5: Эц 400 мг/кг (n = 10)	27 [27; 29]	4,0 [4, 0; 5, 1]*	23 [21; 24]	24 [19; 35]	137 [102; 143]	143 [129; 149]	9 [8; 10]
Группа 6: Им 5 мл/кг (n = 11)	28 [27; 30]	4,9 [3, 8; 5, 7]*	29 [26; 30]	37 [34; 42]	159 [140; 200]	188 [153; 235]	9 [8; 12]
Группа 7: MTX 10 мг/кг (n = 12)	24 [24; 26]*	4,2 [3, 0; 5, 2]*	18 [17; 22]*	23 [16; 30]*	131 [106; 158]	158 [118; 166]	8 [7; 11]
Группа 8: MTX 10 мг/кг + Эц 50 мг/кг (n = 10)	28 [26; 30]#	3,6 [3, 0; 3, 8]*	24 [23; 24]	34 [33; 37]#	155 [136; 166]	140 [138; 165]	9 [9; 9]
Группа 9: MTX 10 мг/кг + Эц 100 мг/кг (n = 10)	28 [26; 30]#□	6,9 [6, 3; 8, 3]#	23 [20; 27]	30 [22; 34]	152 [150; 167]	189 [185; 190]□	11 [8; 12]
Группа 10: MTX 10 мг/кг + Эц 200 мг/кг (n = 10)	24 [24; 27]	4,3 [3, 0; 6, 1]	24 [23; 24]	25 [19; 28]*	138 [119; 141]	167 [146; 188] □	9 [8; 9]
Группа 11: MTX 10 мг/кг + Эц 400 мг/кг (n = 10)	29 [26; 30]#	3,5 [3, 0; 4, 1]*	32 [28; 34]#	23 [20; 25]*	159 [147; 174]	212 [192; 275]#□	9 [9; 9]
Группа 12: MTX 10 мг/кг + Им 5 мл/кг (n = 12)	28 [26; 29]	4,8 [4, 0; 5, 3]*	25 [19; 31]	33 [24; 48]#	105 [92; 146]	129 [119; 141]	10 [8; 13]

Примечания: различия достоверны при р ≤ 0,05: * – по сравнению с животными 1-й группы; # – по сравнению с животными 7-й группы; □ – по сравнению с животными 12-й группы; n – число животных в каждой группе.

 

Таким образом, анализ выявленных изменений массы и количества клеток органов иммунной системы мышей, получавших экстракт травы цикория и препарат сравнения «Иммунал», показал отсутствие изменений данных показателей по сравнению с интактной группой животных. В то же время сухой экстракт травы Cichorium intybus L. восстанавливал массу (тимус, селезенка) и количество клеток (тимус, селезенка, костный мозг) органов иммунной системы животных, получавших цитостатик MTX, что было сопоставимо с эффектом препарата сравнения «Иммунал».

Учитывая вышесказанное, следует отметить, что сухой экстракт травы Cichorium intybus L. является модификатором активности клеток иммунной системы человека, что осуществляется посредством снижения уровня провоспалительных цитокинов и повышения уровня противовоспалительного цитокина IL-10 мононуклеарами периферической крови человека в системе in vitro, а также восстанавливает параметры иммунной системы животных, находящихся в состоянии иммунодефицита, что выражается в увеличении массы (тимус, селезенка) и количества клеток (тимус, селезенка, костный мозг) мышей, получавших цитостатик MTX, до показателей интактных животных.

Обсуждая полученные результаты, необходимо отметить, что иммунорегуляторный эффект сухого экстракта травы цикория в системе in vitro может быть обусловлен накоплением в данном экстракте фенольных соединений, которые могут способствовать снижению продукции мононуклеарными клетками провоспалительных факторов, что может быть связано с влиянием на синтез провоспалительных цитокинов через экспрессию генов в иммунокомпетентных клетках [13]. Показано, что фенольные соединения растений посредством ингибирования путей NF-κB и STAT3 (преобразователь сигнала и активатор транскрипции) снижают экспрессию провоспалительных генов в иммунокомпетентных клетках [11], что обусловливает снижение образования провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IFNγ. Кроме того, снижение выработки провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками на фоне экстракта цикория может быть связано с повышением продукции мононуклеарами IL-10, являющегося супрессирующим фактором практически всех провоспалительных цитокинов [14]. В то же время снижение уровня противовоспалительного цитокина IL-1Ra в культуральной среде мононуклеаров в присутствии экстракта цикория может быть обусловлено выраженным его ингибированием IL-6, который может оказывать и противовоспалительный эффект, подавляя продукцию IL-1, TNFα и индуцируя секрецию IL-1Ra [9].

В свою очередь, иммунорегуляторное действие экстракта цикория в системе in vivo также может быть связано с содержанием в нем фенольных соединений, которые способны подавлять иммуносупрессивное действие цитостатиков [4, 8]. По данным литературы [6] известно, что применение цитостатиков, в том числе и MTX, способно приводить к подавлению пролиферации и дифференцировки интенсивно делящихся клеток, к которым могут быть отнесены клетки лимфоидной системы. Это может происходить за счет снижения внутриклеточных запасов восстановленного глутатиона и повреждения системы антиоксидантной защиты иммунокомпетентных клеток, приводящего к окислению клеточных макромолекул, изменению их функций и к снижению функциональной активности вплоть до гибели [6]. Возможно, вышеописанный процесс является одной из причин снижения количества клеток иммунной системы на фоне применения цитостатиков, в том числе MTX [6]. Применение флавоноидов и других фенольных соединений, в соответствии с данными литературы [6], стимулирует систему антиоксидантной защиты клетки путем замедления процессов свободнорадикального окисления.

Таким образом, сухой экстракт травы Cichorium intybus L. может быть рассмотрен в качестве перспективного средства, восстанавливающего параметры иммунной системы в условиях иммуносупрессии, индуцированной MTX, до уровня показателей интактных мышей, подавляющего синтез провоспалительных цитокинов и стимулирующего секрецию противовоспалительного цитокина IL-10. Следует также отметить, что активность данного экстракта связана с высоким содержанием в нем фенольных соединений. Учитывая вышесказанное, дальнейшее изучение травы цикория и сухого экстракта из нее целесообразно и направлено на создание новых эффективных растительных препаратов, регулирующих функции иммунной системы организма.

Выводы:

1. Сухой экстракт травы Cichorium intybus L. подавляет выработку мононуклеарными клетками цитокинов, являющихся ключевыми провоспалительными медиаторами Тh1-иммунного ответа: TNFα, IL-6, и IFNγ, и, напротив, стимулирует секрецию противовоспалительного цитокина Тh2-иммунного ответа IL-10.
2. Установлено, что сухой экстракт травы Cichorium intybus L. не оказывает влияния на массу (тимус, селезенка) и количество клеток (тимус, селезенка, костный мозг) органов иммунной системы беспородных интактных мышей, что сопоставимо с эффектом препарата сравнения «Иммунал».
3. Выявлена способность сухого экстракта травы Cichorium intybus L. восстанавливать показатели массы (тимус, селезенка) и количества клеток (тимус, селезенка, костный мозг) органов иммунной системы беспородных мышей в модельном эксперименте иммунодефицита до уровня показателей интактных мышей, что сопоставимо с эффектом препарата сравнения «Иммунал».
4. Вышеописанные эффекты сухого экстракта травы Cichorium intybus L. позволяют предположить, что изученный экстракт является перспективным иммунорегуляторным средством и может быть использован для дальнейшей работы по разработке эффективных растительных препаратов иммунонаправленного действия.

About the authors

Irina V. Mikhailova

Orenburg State Medical University

Email: michaylova74@yandex.ru

д.б.н., доцент, заведующий кафедрой фармацевтической химии 

Russian Federation, Orenburg

Elena V. Ivanova

Orenburg State Medical University

Author for correspondence.
Email: walerewna13@gmail.com

д.м.н., доцент кафедры фармацевтической химии 

Russian Federation, Orenburg

Alexander I. Smolyagin

Orenburg State Medical University

Email: probllab.orenburg@mail.ru

д.м.н., профессор, заслуженный работник высшей школы РФ, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики 

Russian Federation, Orenburg

Anatoly I. Bondarenko

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis Ural Branch of RAS

Email: anat1998bond@mail.ru

ассистент кафедры фармацевтической химии 

Russian Federation, Orenburg

Angelina A. Sinegovets

Orenburg State Medical University

Email: a.a.sinegovets@yandex.ru

ассистент кафедры фармацевтической химии 

Russian Federation, Orenburg

Taisiya A. Bondarenko

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis Ural Branch of RAS

Email: semenovih88@gmail.com

научный сотрудник лаборатории инфекционной симбиологии 

Russian Federation, Orenburg

Anastasia V. Bekpergenova

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis Ural Branch of RAS

Email: nsavasteeva@gmail.com

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории инфекционной симбиологии 

Russian Federation, Orenburg

References

Supplementary files