Evaluation of the production of oppositional cytokines IL-6 and IL-10 in the culture of mononuclear blood leukocytes in rats with metabolic syndrome

Olga V. Voronkova; Воронкова Ольга Владимировна; Yulia G. Birulina; Бирулина Юлия Георгиевна; Irina Ye. Esimova; Есимова Ирина Евгеньевна; Reseda R. Khasanova; Хасанова Резеда Рахматулловна; Vladimir V. Ivanov; Иванов Владимир Владимирович; Evgeny E. Buiko; Буйко Евгений Евгеньевич; Nikita A. Chernyshov; Чернышов Никита Алексеевич

doi:10.17816/CI2023231-2

Evaluation of the production of oppositional cytokines IL-6 and IL-10 in the culture of mononuclear blood leukocytes in rats with metabolic syndrome

Authors: Voronkova O.V.¹, Birulina Y.G.¹, Esimova I.Y.¹, Khasanova R.R.¹, Ivanov V.V.¹, Buiko E.E.¹, Chernyshov N.A.¹
Affiliations:
1. Siberian State Medical University
Issue: Vol 20, No 1 (2023)
Pages: 13-17
Section: Original Study Articles
URL: https://cijournal.ru/1684-7849/article/view/623744
DOI: https://doi.org/10.17816/CI2023231-2
ID: 623744

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Aim: to evaluate the secretory activity of mononuclear blood leukocytes by the level of in vitro production of oppositional cytokines (pro-inflammatory IL-6 and anti-inflammatory IL-10) in rats in a model of diet-induced metabolic syndrome (MS) against the background of changes in the concentration of adipokines leptin and adiponectin.

Materials and methods. In male Wistar rats, MS was modeled by keeping for 12 weeks on a high-fat and high-carbohydrate diet; control group animals received a normal diet. Mononuclear leukocytes isolated by gradient centrifugation from heparinized blood were cultured in a medium based on RPMI-1640 (concentration of 2×10⁶ cells in 1 ml of medium) for 24 hours in sterile tubes in a CO₂-incubator in two variants – without the addition of an inducer and with the addition of bacterial lipopolysaccharide (LPS). The concentration of cytokines in the culture fluid, hormones leptin and adiponectin in the blood serum was determined by enzyme immunoassay. Statistical data processing was carried out in the SPSS Statistics 23.

Results. In animals exposed to a 12-week high-fat and high-carbohydrate diet, against the background of an increase in body weight, the specific mass of visceral adipose tissue, metabolic disorders (hyperglycemia, impaired glucose tolerance, dyslipidemia), high concentrations of leptin and low concentrations of adiponectin, the ability of mononuclear blood leukocytes to produce IL-6 and IL-10 in vitro at the basal level and when stimulated by bacterial LPS does not change.

Conclusion. Probably, the morphofunctional status and secretory profile of monocyte-macrophage system cells depends on the severity and duration of the metabolic and hormonal imbalance associated with obesity and systemic chronic inflammation.

Keywords

metabolic syndrome, mononuclear leukocytes, cytokines, inflammation

Full Text

Введение

Применение современных технологий транскриптомого анализа и проточной цитометрии способствовало пересмотру представлений о субпопуляционной гетерогенности и функциональной пластичности моноцитов крови, а также их роли в развитии и прогрессировании хронических неинфекционных заболеваний, таких как кардиоваскулярная патология, хроническая обструктивная болезнь легких, сахарный диабет 2-го типа, ожирение и др. [1]. Важная роль в патогенезе данных заболеваний отводится хроническому воспалению, при этом клетки моноцитарно-макрофагальной системы выступают в качестве основных регуляторных и эффекторных элементов, опосредующих стереотипные и специфические воспалительные изменения в органах и тканях. Как известно, в большей степени эффекторный потенциал рекрутируемых в ткани циркулирующих моноцитов формируется элементами микроокружения в очаге воспаления. Однако функциональный фенотип моноцитов крови может быть преформирован на фоне системных нарушений обмена веществ, сопровождающих многие хронические неинфекционные заболевания в сочетании с метаболическим синдромом (МС).

В ряде исследований было показано, что факторы МС могут модифицировать функции циркулирующих моноцитов – будущих тканевых макрофагов. В литературе описан феномен под названием «диабетическое прекондиционирование моноцитов и макрофагов», суть которого заключается в том, что на фоне гипергликемии происходит эпигенетическое изменение транскрипционного профиля циркулирующих моноцитов и их костномозговых предшественников, что выражается изменением продукции цитокинов в зависимости от типа активирующих или ингибирующих стимулов [2]. Например, известно, что пептидные гормоны жировой ткани способны значительно модулировать функциональную активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов, реализуя свои провоспалительные (лептин, резистин, висфатин) либо противоспалительные эффекты (адипонектин) [3]. При этом дисбаланс секреторной активности может наблюдаться в отношении цитокинов всех функциональных групп – ростовых факторов, регуляторов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов, медиаторов воспаления и др. и проявляться нарушением соотношения цитокинов с про- и противовоспалительными эффектами. Современные представления о роли цитокинов с про- и противовоспалительными эффектами в патогенезе хронического асептического воспаления на фоне метаболических нарушений [4] позволяют нам рассматривать соотношение IL-6 / IL-10 в качестве одного из интегративных критериев дезрегуляции функционального фенотипа мононуклеарных лейкоцитов. Ввиду того, что системное хроническое воспаление при МС тесно связано с функциональной активностью адипоцитов [5], анализ изменений цитоконпродуцирующей активности лейкоцитов крови во взаимосвязи с такими биомаркерами, как лептин и адипонектин, представляется интересным для идентификации факторов, способствующих специфическим функциональным изменениям циркулирующих моноцитов и их производных.

Цель исследования – оценка секреторной активности мононуклеарных лейкоцитов крови по уровню продукции in vitro оппозитных цитокинов (провоспалительного IL-6 и противовоспалительного IL-10) у крыс в модели диет-индуцированного МС на фоне изменения концентрации адипокинов лептина и адипонектина.

Материалы и методы

МС моделировали на 6-недельных крысахсамцах Вистар (n = 18) посредством содержания в течение 12 нед. на высокожировой и высокоуглеводной диете, состоящей из стандартного корма с добавлением животного жира (топленое сало, 17 %), фруктозы (17 %), холестерина (0,25 %) и с заменой питьевой воды на 20%-ный раствор фруктозы (состав диеты: белки 16 %, жиры 22 %, углеводы 54 %). Способ моделирования, а также процедура комплексной оценки сформированности функциональных и лабораторных признаков МС у экспериментальных животных описаны нами ранее [6]. Контрольная группа (n = 15) получала стандартный корм и воду для питья ad libitum. Все манипуляции проводили с соблюдением Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.). Протокол исследования был одобрен Этическим комитетом ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (заключение № 8201 от 27.03.2020).

Выведение животных из эксперимента осуществляли методом СО₂-асфиксии. Кровь отбирали из сердца в пробирку с активатором свертывания для получения сыворотки и последующего иммуноферментного анализа, а также в вакуумную систему полиэфирный гель / Ficoll™ (BD Vacutainer СPT) с антикоагулянтом гепарином натрия для последующего выделения мононуклеарных лейкоцитов методом градиентного центрифугирования. После выделения и однократной отмывки клетки ресуспендировали в 1 мл полной питательной среды (90 % среды RPMI-1640 с L-глутамином, 10 % ЭТС, 10 мг/мл гентамицина, 10 мМ HEРES), в счетной камере определяли их количество и жизнеспособность в реакции с трипановым синим. Расчет объема клеточной суспензии для дальнейшего культивирования проводили с учетом жизнеспособности не менее 95 % клеток в первичной культуре и конечной концентрации клеток в каждой пробе 2×10⁶/мл. Культивирование клеток осуществляли в круглодонных стерильных пробирках в полной питательной среде при температуре 37 °С в СО₂-инкубаторе (концентрация 5 %) в двух вариантах: 1) проба без добавления индуктора; 2) проба с добавлением липополисахарида (ЛПС) E. coli O55:B5(LPS) (Servicebio, Китай) в конечной концентрации 10 мкг/мл. После 24-часовой инкубации пробирки встряхивали, центрифугировали, клетки осадка повторно исследовали на жизнеспособность. В надосадочной жидкости методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяли концентрацию цитокинов с использованием наборов Rat IL-6 ELISA Kit и Rat IL-10 ELISA Kit (ABclonal Biotechnology Co., Ltd, Китай). В сыворотке крови методом ИФА определяли концентрацию лептина и адипонектина (наборы Rat LEP (Leptin) ELISA Kit и Rat ADP (Adiponectin) ELISA Kit (ELK Biotechnology, Китай).

Статистическую обработку данных проводили в программе SPSS Statistics 23. Данные, подчиняющиеся нормальному закону распределения, представляли в виде среднего и стандартного отклонения (M±SD), не подчиняющиеся – медианы (Me) и межквартильного интервала (Q25; Q75). Анализ различий между выборками выполняли при помощи t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна-Уитни. При уровне значимости р < 0,05 различия считали статистически значимыми. Для оценки статистической взаимосвязи между количественными показателями вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r).

Результаты и обсуждение

В результате воздействия модифицированного пищевого рациона у крыс опытной группы в отличие от интактных животных формировались признаки метаболических нарушений, характерных для МС, а именно артериальная гипертензия, увеличение массы тела, повышение удельного веса печени и висцеральной жировой ткани. При проведении биохимических тестов было установлено нарушение толерантности к глюкозе, гипергликемия натощак, а также изменения показателей липидного спектра, выражающиеся в повышении уровней триацилглицеролов, общего холестерина, а также холестерина в составе липопротеинов низкой и очень низкой плотности [6].

По результатам проведенного ИФА концентрация лептина в сыворотке крови у крыс с МС составила 4,5±0,1 нг/мл и оказалась выше соответствующих значений у животных контрольной группы (3,1±0,3 нг/мл) в среднем в 1,5 раза (р < 0,05). Концентрация адипонектина в крови у крыс опытной группы составила 4,1±0,6 нг/мл и была ниже таковой у интактных животных (5,8±2,3 нг/мл, р < 0,05).

Способность синтезировать большое количество медиаторов, включая цитокины, хемокины, белки внеклеточного матрикса, гормоны, факторы роста и вазоактивные вещества, определяет функциональный плейотропизм висцеральной жировой ткани и ее системное влияние на различные физиологические и патологические процессы в организме [7]. Высокая концентрация лептина в крови свидетельствует о повышении секреторной активности гипертрофированных адипоцитов, что представляется вполне закономерным при увеличении массы висцеральной жировой ткани у животных, подвергнутых высокожировой и высокоуглеводной диете. Полученные нами данные относительно концентрации лептина в целом согласуются с результатами ряда других экспериментальных и клинических исследований, регистрирующих наличие гиперлептинемии при метаболическом синдроме. При этом изменение гормональной активности висцеральной жировой ткани при ее избыточном накоплении, как правило, характеризуется снижением продукции адипонектина [8]. Адипонектин обладает антидиабетическим, антиатерогенным, противовоспалительным, иммуномодулирующим и вазопротективным действием [9]. В нашем эксперименте низкая концентрация адипонектина у крыс с МС может свидетельствовать о несостоятельности механизмов, направленных на компенсацию провоспалительных эффектов лептина. Установлено, что лептин по структуре и молекулярным механизмам сигнальной трансдукции сходен с цитокинами и способен стимулировать функциональную активность лимфоцитов и мононуклеарных фагоцитов, усиливая продукцию провоспалительных цитокинов [8]. Тем не менее в результате исследования цитокинпродуцирующей активности мононуклеарных лейкоцитов в культуре in vitro мы не зарегистрировали статистически значимых различий в наработке как провоспалительного IL-6, так и противовоспалительно IL-10 у животных опытной и контрольной групп (таблица).

Таблица. Концентрация цитокинов в культуре мононуклеарных лейкоцитов крови у крыс контрольной группы и с МС (Me (Q1; Q3))

Группа	Условия культивирования	Концентрация IL-6, пг/мл	Концентрация IL-10, пг/мл
Контрольная группа (n = 15)	Без индуктора	255,75 (122,11; 361,00)	0,00
Контрольная группа (n = 15)	В присутствии ЛПС	535,15 (453,80; 1295,00) р < 0,05	39,17 (12,76; 47,91)
Группа МС (n = 18)	Без индуктора	263,70 (210,80; 411,20)	0,00
Группа МС (n = 18)	В присутствии ЛПС	595,70 (457,20; 1395,00) р < 0,05	29,12 (13,24; 59,91)

Примечание: p – уровень значимости различий по сравнению с пробой без индуктора (U-критерий Манна-Уитни).

Следует также отметить, что мононуклеарные лейкоциты в обеих группах одинаково отвечали на стимуляцию, статистически значимо повышая уровень наработки исследуемых цитокинов в присутствии бактериального ЛПС. В ранее проведенных нами экспериментах у крыс в модели индуцированного диетой МС были зарегистрированы общие признаки воспаления, в том числе характеризующиеся повышением в крови концентрации цитокинов TNF-α и IL-10 (в среднем в 4,2 и 3,7 раз и соответственно по сравнению с контрольными значениями) в сочетании с гиперинсулинемией и гиперлептинемией. Изменений сывороточной концентрации IL-6 у животных опытной группы зарегистрировано не было [10]. Сопоставляя полученные результаты, можно предположить, что высокий уровень цитокинов в крови при МС поддерживается за счет секреторной активности тканевых клеточных элементов, при этом функциональная активность циркулирующих мононуклеарных лейкоцитов не изменяется. Вероятно, изменения функционального фенотипа циркулирующих клеток в отношении наработки исследуемых цитокинов отсрочены либо зависят от концентрации (дозы) модулирующих факторов (глюкозы, триацилглицеролов, гуморальных факторов воспаления и адипокинов). В подтверждение данному тезису мы не выявили каких-либо значимых корреляционных взаимосвязей между концентрацией гормонов (лептина и адипонектина) в крови, базальной и ЛПС-индуцированной продукцией цитокинов в культуре мононуклеарных лейкоцитов у животных опытной и контрольной групп. В связи с этим интерес представляет дальнейшее изучение взаимозависимости морфофункционального статуса и секреторного профиля клеток моноцитарно-макрофагальной системы, степени выраженности и длительности метаболического и гормонального дисбаланса, ассоциированного с ожирением и системным хроническим воспалением при экспериментальном МС.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации (МК-3302.2022.1.4).