АНТИЦИТОКИНОВАЯ АКТИВНОСТЬ И ПРОДУКЦИЯ ЦИТОКИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫМИ БАКТЕРИЯМИ, ВЫДЕЛЕННЫМИ ОТ БОЛЬНЫХ С ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫМИ ОСЛОЖНЕНИЯМИ

Полный текст

Введение

Микроорганизмы, в частности грамотрицательные бактерии разной видовой принадлежности (прежде всего, энтеробактерии и неферментирующие бактерии), вызывающие послеоперационные инфекционно-воспалительные осложнения у больных в хирургических стационарах, обладают не только факторами патогенности, но и персистентными свойствами, которые обеспечивают защиту возбудителей от эффекторов иммунитета макроорганизма и способствуют реализации их патогенного потенциала при инфицировании органов и тканей [1]. С другой стороны, известно, что на течение и исход любого инфекционно-воспалительного процесса влияют цитокины, которые обеспечивают регуляцию иммунного ответа макроорганизма при внедрении возбудителя  [2]. В то же время установлено, что микроорганизмы разных видов обладают антицитокиновой активностью (АЦА), то есть способны инактивировать те или иные про- и противовоспалительные цитокины [3-5], а также могут продуцировать цитокиноподобные вещества (ЦПВ) [6]. Указанные особенности бактериальных патогенов способны повлиять на локальный цитокиновый баланс в инфицированных тканях макроорганизма, повышая риск возникновения инфекционно-воспалительных осложнений у пациентов хирургического профиля. 

В связи с этим целью настоящего исследования явилась характеристика антицитокиновой активности и способности к продукции цитокиноподобных веществ у грамотрицательных бактерий разных видов, выделенных при послеоперационных осложнениях.

Материалы и методы

В эксперименты in vitro были включены клинические штаммы грамотрицательных бактерий следующих видов: Escherichia coli (n=6), Klebsiella pneumoniae (n=6), Citrobacter freundii (n=6), C. braakii (n=6), Pseudomonas aeruginosa (n=6), P. putida (n=6), Stenotrophamonas maltophilia (n=6), изолированных от больных с послеоперационными осложнениями.  

Выделение чистых культур бактерий осуществляли бактериологическим методом, а их видовую идентификацию проводили по прямому белковому профилированию с помощью масс-спектрометра MALDI TOF MS серии Microflex LT (BrukerDaltonics, Германия) и программного обеспечения MaldiBioTyper 3,0.

АЦА бактерий в отношении ряда цитокинов (противовоспалительных –IL1RА и IL4 и провоспалительных –  IL8 и TNFα) определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по известной методике [7] с использованием наборов ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург). Для этого в центрифужные пробирки вносили по 150 мкл в соотношении 1:1 взвеси бактерий (по стандарту мутности МакФарланда – 0,5 ед.) и растворы соответствующих цитокинов, пробы инкубировали в течение 2 часов при 37°С. После инкубации реакцию останавливали на холоде (+4°С), центрифугировали с охлаждением при 3000 об/мин в течение 15 мин при +4°С и отбирали супернатанты. В качестве контроля использовали растворы цитокинов с добавлением физиологического раствора NaCl. Конечная концентрация цитокинов в опытных и контрольных пробах составляла для IL1RА – 416,6 пг/мл, IL4 – 28,6 пг/мл, IL8 – 62,5 пг/мл и TNFα – 41,6 пг/мл. Результаты учитывали на фотометре StatFax 2100 (США) при длине волны 450 нм. Уровни АЦА и продукции ЦПВ рассчитывали с учетом доли инактивации или продукции соответствующих цитокинов в опыте относительно контроля, выражая в пг/мл. Наличие у бактерий данных признаков регистрировали, если их выраженность превышала 5 пг/мл. 

Полученные данные статистически обработаны с помощью критерия Стьюдента (Statistica 6.0; StatSoft, Inc.).  Результаты представлены в виде средних значений и ошибок средних (М±m), полученных не менее чем в трех независимых экспериментах. Значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Полученные экспериментальные данные свидетельствовали о том, что отдельные изученные штаммы микроорганизмов двух групп (энтеробактерии и неферментирующие грамотрицательные бактерии – НГОБ), выделенные от больных с послеоперационными осложнениями, были способны инактивировать цитокины – IL1RА, IL4, IL8 и TNFα (табл. 1), а также продуцировать цитокиноподобные вещества (ЦПВ), соответствующие указанным цитокинам (табл. 2). При этом наблюдалась межродовая и межвидовая, а также внутривидовая (межштаммовая) вариабельность изученных грамотрицательных бактерий, как по частоте встречаемости, так и по выраженности указанных свойств.

Табл. 1. Распространенность и выраженность антицитокиновой активности (АЦА) у штаммов грамотрицательных бактерий разных видов, выделенных при послеоперационных осложнениях

Группа и вид бактерий (n – количество штаммов)	Частота встречаемости (абс./%) и выраженность АЦА (пг/мл) у грамотрицательных бактерий в отношении определенных цитокинов*
	IL1RА	IL4	IL8	TNFα
Энтеробактерии (n=24), в том числе:	6/25,0. 356,2±7,9	16/66,7  25,9±2,2	4/16,7 61,3±2,6	8/33,3/ 31,7±3,1
Escherichia coli (n=6)	2/33,3. 303,3±10,4	2/33,3 25,5±2,4	2/33,3 62,0±1,4	4/66,7 25,4±3,4
Klebsiella pneumoniae (n=6)	4/66,7 409,1±5,5	4/66,7 26,6±1,8	н/в	н/в
Citrobacter freundii (n=6)	н/в	4/66,7 24,8±2,5	н/в	2/33,3 40,5±4,4
Citrobacter braakii (n=6)	н/в	6/100,0 26,7±2,2	2/33,3 60,7±3,9	2/33,3 25,6±2,6
НГОБ (n=18), в том числе:	2/11,1 329,5±6,8	16/88,9 27,2±2,1	7/38,9 45,3±3,1	10/55,6 39,3±3,3
Pseudomonas aeruginosa (n=6)	н/в	6/100,0 26,2±2,2	3/50,0 38,7±2,8	6/100,0 38,9±2,4
Pseudomonas putida (n=6)	2/33,3 329,5±6,8	6/100,0 28,0±2,4	н/в	2/33,3 40,9±3,4
Stenotrophamonas maltophilia (n=6)	н/в	4/66,7 25,5±1,7	4/66,7 51,9±3,4	2/33,3 38,2±4,2
ВСЕГО (n=42)	8/19,0 342,8±7,3	32/76,2 26,5±2,1	11/26,2 53,3±2,8	18/42,9 35,5±3,2

Примечание: * в числителе указана частота встречаемости штаммов с данным признаком (абс./%); в знаменателе – уровень выраженности данного признака (пг/мл); н/в – признак не выявлен; ** НГОБ - неферментирующие грамотрицательные бактерии. 

 

Из данных, представленных в таблице 1, видно, что отдельные клинические штаммы микроорганизмов изученных родов/видов из обеих групп (энтеробактерии и НГОБ) были способны инактивировать те или иные цитокины. Чаще всего они проявляли АЦА в отношении противовоспалительного цитокина IL4 (76,2%), причем распространенность этого признака среди неферментирующих грамотрицательных бактерий                (P. aeruginosa, P. putida,  S. maltophilia) была несколько выше, чем у энтеробактерий – E. coli, K. pneumoniae, C. freundii и C. braakii (88,9 против 66,7%, p<0,05). Способность инактивировать другие цитокины (IL1RА, IL8 и TNFα) у клинических изолятов грамотрицательных бактерий встречалась значительно реже с градиентом: 19,0-26,2-42,9% соответственно. При этом у штаммов бактерий определенных видов/родов в анализируемых выборках отсутствовала АЦА в отношении некоторых цитокинов. Так, например, у изолятов микроорганизмов рода Citrobacter, а также видов P. aeruginosa и S. maltophilia не выявлена АЦА в отношении IL1RА, у штаммов K. pneumoniae, C. freundii и P. putida не обнаружена способность инактивировать IL8, а в выборке K. pneumoniae отсутствовали культуры с АЦА в отношении TNFα.

Не меньшее разнообразие демонстрировали изученные штаммы грамотрицательных бактерий по уровню выраженности АЦА. У микроорганизмов, проявлявших способность инактивировать цитокины, относительно широкие диапазоны варьирования уровней АЦА наблюдались в отношении инактивации IL1RА и IL8 (303,3-409,1 и 38,7-62,0 пг/мл соответственно), тогда как в отношении ингибирования IL4 и TNFα уровни АЦА были более гомогенными (24,8-28,0 и 25,4-40,9 пг/мл соответственно).

Анализ выраженности способности к инактивации цитокинов у грамотрицательных микроорганизмов изученных групп выявил более высокие значения  АЦА у энтеробактерий, чем у НГОБ в отношении IL1RА (356,2±7,9 против 329,5±6,8 пг/мл, р<0,05) и IL8 (61,3±2,6 против 45,3±3,1 пг/мл, р<0,01); по другим иммуномодуляторам межгрупповые отличия АЦА указанных бактерий были не достоверны.

Среди энтеробактерий и НГОБ наблюдались межродовые и межвидовые различия по отдельным вариантам АЦА. Так, у K. pneumoniae в сравнении с E. coli существенно выше была АЦА в отношении IL1RА (409,1±5,5 против 303,3±10,4 пг/мл, р<0,01), у C. freundii выше был уровень АЦА в отношении TNFα, чем у C. braakii (40,5±4,4 против 25,6±2,6 пг/мл, р<0,05), а S. maltophilia проявляли более высокую АЦА в отношении IL8, чем P. aeruginosa (51,9±3,4 против 38,7±2,8 пг/мл, р<0,05).    

Необходимо подчеркнуть, что представленные в таблице 1 абсолютные значения АЦА указывали на то, что грамотрицательные бактерии способны инактивировать от 61 до 99% цитокинов, находящихся в реакционной смеси с микроорганизмами. Кроме того, следует отметить, что сочетанную АЦА в отношении нескольких цитокинов проявляли 8,0% штаммов энтеробактерий и 22,2% изолятов НГОБ, при этом «ядром» таких комбинаций выступала способность бактерий инактивировать IL4, а наиболее частыми сочетаниями были АЦА против двух цитокинов – IL4+TNFα (14%) и IL4+IL8 (14%). Ассоциированная АЦА в отношении 3 цитокинов (IL4+IL8+TNFα) встречалась только у штаммов P. aeruginosa в 50% случаев.

В совокупности эти результаты указывают на  значительную внутри- и межвидовую вариабельность грамотрицательных микроорганизмов (энтеробактерии и НГОБ) по частоте встречаемости и уровню выраженности у них способности к инактивации отдельных цитокинов, что, по-видимому, может отражаться на характере течения вызванных ими инфекционно-воспалительных процессов, в том числе, за счет изменения локального цитокинового баланса в инфицированных тканях.

При этом нельзя исключить, что определенный вклад в локальный цитокиновый статус могут вносить вегетирующие в пораженных тканях возбудители, способные продуцировать в среду цитокиноподобные вещества (ЦПВ). Полученные нами данные указывали на продукцию таких веществ некоторыми клиническими штаммами грамотрицательных бактерий, выделенными от больных с инфекционно-воспалительными осложнениями (табл. 2).

В частности, установлено, что 66,7% изолятов энтеробактерий разных видов (кроме K. pneumoniae) и 88,9% штаммов НГОБ являлись продуцентами IL1RА-подобных веществ, тогда как в этих же группах удельный вес бактериальных культур, продуцирующих другие ЦПВ (соответствующие IL4, IL8 и TNFα), был значительно меньше (11,1-22,2%) и зависел от их видовой/родовой принадлежности. Так, в группе энтеробактерий среди штаммов E. coli отсутствовали продуценты IL4- и IL8-подобных веществ, изоляты C. freundii не секретировали в среду IL8- и TNFα-подобные вещества, а культуры C. braakii – ЦПВ, соответствующие всем трем указанным цитокинам (IL4, IL8 и TNFα). Что касается НГОБ, то способность к продукции IL4-, IL8- и TNFα-подобных веществ не обнаруживалась у бактерий вида P. aeruginosa, тогда как продуцентами IL8- и TNFα-подобных веществ являлись 66,7% штаммов P. putida, а 33,3% изолятов S. maltophilia секретировали в среду вещества,  подобные IL4.

 

Табл. 2. Распространенность и выраженность способности к продукции ЦПВ у штаммов грамотрицательных бактерий разных видов, выделенных при инфекционно-воспалительных послеоперационных осложнениях 

 

Группа и вид бактерий (n – количество штаммов)	Частота встречаемости (абс./%) и уровень выраженности (пг/мл) способности к продукции ЦПВ у грамотрицательных бактерий
	IL1RА	IL4	IL8	TNFα
Энтеробактерии (n=24), в том числе:	16/66,7 165,7±5,2	4/16,7 11,5±0,5	6/25,0 14,2±1,2	8/33,3 16,1±0,9
Escherichia coli (n=6)	4/66,7 364,5±11,5	н/в	н/в	2/33,3 26,3±1,5
Klebsiella pneumoniae (n=6)	н/в	2/33,3 8,3±0,6	6/100 14,2±1,2	6/100 5,9±0,3
Citrobacter freundii (n=6)	6/100,0 55,0±1,8	2/33,3 14,7±0,4	н/в	н/в
Citrobacter braakii (n=6)	6/100 77,5±2,4	н/в	н/в	н/в
НГОБ (n=18), в том числе:	16/88,9 62,6±4,3	2/11,1 7,9±0,5	4/22,2 28,7±1,3	4/22,2 11,9±0,7
Pseudomonas aeruginosa (n=6)	6/100,0 58,9±3,4	н/в	н/в	н/в
Pseudomonas putida (n=6)	4/66,7 67,1±5,2	н/в	4/66,7 28,7±1,3	4/66,7 11,9±0,7
Stenotrophamonas maltophilia (n=6)	6/100,0 61,7±4,2	2/33,3 7,9±0,5	н/в	н/в
ВСЕГО (n=42)	32/76,2 114,15±4,7	6/14,3 9,7±0,5	10/23,8 21,5±1,2	12/28,6 12,1±0,7

Примечание: * в числителе указана частота встречаемости штаммов с данным признаком (абс./%); в знаменателе – уровень выраженности данного признака (пг/мл); н/в – признак не выявлен; ** НГОБ - неферментирующие грамотрицательные бактерии. 

 

Выраженность способности к продукции отдельных ЦПВ грамотрицательными бактериями существенно колебалась в зависимости от групповой и видовой принадлежности микроорганизмов (табл. 2). Так, средний уровень продукции IL1RA-подобных веществ у энтеробактерий в два раза превышал таковой у НГОБ (165,7±5,2 против 62,6±4,3 пг/мл соответственно, р<0,05) и был максимальным у штаммов E. coli (364,5±11,5 пг/мл), в то время как у изолятов C. freundii и C. braakii он составлял 55,0±1,8 и 77,5±2,4 пг/мл соответственно (р<0,05), а у штаммов НГОБ разных видов/родов он варьировал в относительно узком диапазоне – 58,9-67,1 пг/мл (р>0,05).

Эти данные указывают на межродовую/межвидовую и внутривидовую (межштаммовую) вариабельность грамотрицательных микроорганизмов (энтеробактерии, НГОБ) по распространенности и выраженности у них способности к продукции определенных ЦПВ, соответствующих таким цитокинам человека, как IL1RA, IL4, IL8 и TNFα, что, наряду с описанной выше вариабельностью этих бактерий по АЦА, вносит существенный вклад в формирование фенотипического разнообразия и, очевидно, патогенного потенциала возбудителей инфекционно-воспалительных осложнений у пациентов хирургического профиля.

Если взглянуть на всю совокупность представленных данных, то можно обнаружить, что в структуру клинических штаммов энтеробактерий и НГОБ входили изоляты, проявляющие АЦА по отношению к определенному цитокину или продуцирующие ЦПВ, соответствующие ему, а также культуры, не обладавшие указанными признаками (рисунок 1). Причем удельный вес таких вариантов бактериальных штаммов зависел как от их групповой принадлежности (энтеробактерии/НГОБ), так и от варианта анализируемого цитокина.

Кроме того, следует отметить, что изученные клинические штаммы грамотрицательных бактерий были способны, с одной стороны, ингибировать как противовоспалительные цитокины (IL1RA и IL4), так и провоспалительные иммуномодуляторы (IL8 и TNFα), с другой стороны, продуцировать в среду вещества, подобные этим регуляторным молекулам. Можно предположить, что такое разнообразие цитокин-ассоциированных характеристик патогенов способно внести существенные «помехи» в цитокин-опосредованную регуляцию воспалительного процесса инфекционной этиологии.   

Рисунок 1. Структура клинических штаммов энтеробактерий и НГОБ с учетом наличия у них АЦА в отношении отдельных цитокинов и способности к продукции определенных ЦПВ.

Figure 1. The structure of clinical strains of enterobacteria and NGOB, taking into account the presence of ACA in relation to individual cytokines and the ability to produce certain CPV.

 

Заключение

Грамотрицательные бактерии (прежде всего, E. coli, K. pneumoniae, Citrobacter spp. и P. aeruginosa) относятся к группе приоритетных возбудителей послеоперационных инфекционно-воспалительных осложнений [8, 9]. В этой связи, всестороннее изучение их патогенных биопрофилей как на фено-, так и генотипическом уровнях, является актуальной задачей медицинской микробиологии. Особый интерес вызывает вопрос о взаимодействии бактерий с иммунорегуляторными факторами и, в частности, про- и противовоспалительными цитокинами, которые принимают непосредственное участие в развитии патологического процесса в инфицированных органах и тканях [2].

В настоящее время накапливается все больше данных о том, что клинические штаммы микроорганизмов разной таксономической принадлежности способны инактивировать/нейтрализовывать различные цитокины, а также продуцировать во внеклеточное пространство цитокиноподобные вещества (ЦПВ). Сегодня известно, что клинические штаммы грамположительных кокков (стафилококки [6] и энтерококки [3]) и грибов рода Candida [4] обладают антицитокиновой активностью (АЦА) в отношении ряда про- и противовоспалительных цитокинов, а также способны продуцировать в среду культивирования различные ЦПВ, то есть обладают «процитокиновой активностью». Кроме того, АЦА была выявлена и у грамотрицательных бактерий, в частности у клинических уроизолятов E. coli, выделенных из мочи пациентов с мочекаменной болезнью [5]. Так, было установлено, что все уроштаммы E. coli, изолированные от больных с послеоперационными инфекционно-воспалительными осложнениями,  характеризовались широкой распространенностью и выраженной экспрессией АЦА в отношении провоспалительных (IL6, IL8 и TNFα) и/или противовоспалительных (IL2, IL10) цитокинов. При анализе у кишечных микросимбионтов способности к инактивации цитокинов было выявлено, что фекальные штаммы K. pneumoniae проявляли высокую АЦА в отношении IL10 и менее выраженную в отношении TNFα и IFNγ, тогда как экзометаболиты псевдомонад проявляли высокую способность снижать в культуральной  среде уровни оппозитных цитокинов  TNFα, IFNγ и IL10 [10].  

Результаты наших исследований позволили охарактеризовать межродовые, межвидовые и внутривидовые/межштаммовые различия в распространенности и выраженности АЦА в отношении IL1RA, IL4, IL8 и TNFα, а также продукции ЦПВ соответствующих цитокинов у клинических изолятов грамотрицательных микроорганизмов (представители семейства Enterobacteriaceae и группа неферментирующих бактерий), выделенных при инфекционно-воспалительных осложнениях у больных хирургического профиля. При этом следует признать, что патогенетическое значение наличия и экспрессии указанных свойств у возбудителей послеоперационных осложнений пока не имеет весомой доказательной базы, что требует проведения дальнейших исследований, в том числе, направленных на выявление взаимосвязей анти- и процитокиновых характеристик бактериальных изолятов с клиническими проявлениями патологического процесса, характером его течения и вариантами исхода. 

Результаты таких исследований могут быть перспективны для разработки алгоритмов диагностики и прогнозирования риска развития послеоперационных инфекционно-воспалительных осложнений при хирургических вмешательствах.

 

Об авторах

Ольга Александровна Пашинина

ФГБУН Оренбургский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук

Email: olga25mikro@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9944-3095
SPIN-код: 9638-7336

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов ИКВС УрО РАН – обособленного структурного подразделения ОФИЦ УрО РАН.

Россия

Татьяна Михайловна Пашкова

ФГБУН Оренбургский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук

Email: pashkova070782@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8075-8249
SPIN-код: 5146-6190

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов 

Россия

Ольга Львовна Карташова

ФГБУН Оренбургский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук

Email: labpersist@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1487-7546
SPIN-код: 9315-1070

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов 

Россия

Людмила Олеговна Фомина

Институт иммунологии и физиологии УрО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: av_zurochka@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8130-8979
SPIN-код: 2678-7689

Лаборатория иммунологии воспаления

Россия

Виктор Александрович Гриценко

ФГБУН Оренбургский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук

Email: vag59@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2086-5170
SPIN-код: 7107-1300

доктор медицинских наук, главный научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов 

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы