BACKGROUND: Transferrin receptor 1 (TfR1, CD71) is a multifunctional protein important for maintaining cellular iron homeostasis by binding to the main iron transporter transferrin (Tf). In addition to Tf, it can bind and transfer proteins, viruses, chemotherapeutic agents, and other biomolecules to the cell. Ferristatin II, a TfR1 degradation inducer, has previously been shown to inhibit SARS-CoV-2 infection in Vero cells; however, this agent cannot be used as a medicinal product, because its metabolism produces carcinogenic benzidine derivatives.
AIM: To assess the antiviral activity of specific azo compounds (structural analogs of ferristatin II) to identify common structural patterns of compounds that are the most effective against SARS-CoV-2. The findings will be used to develop safer antiviral analogs of ferristatin II.
METHODS: The paper investigates the antiviral activity of 15 compounds, including 5 de novo compounds generated by organic synthesis. The antiviral activity of the drugs was evaluated by their ability to inhibit the replication of SARS-CoV-2 Delta in Vero cell culture. Cytotoxicity of the compounds for this cell line was determined by the MTS assay. Additionally, the ability of the most effective compounds to inhibit iron uptake by Vero cells was assessed using the HMRhoNox-M chemosensor.
RESULTS: In the studied stains similar to ferristatin II, direct black (average inhibitory concentration IC50 = 53.7 μM), direct green (IC50 = 53.6 μM), direct diazo black C (IC50 = 28.2 μM), and direct black 2K (IC50 = 45.3 μM) inhibited the viral activity. In addition, direct green showed pronounced toxicity to Vero cells (CC50 = 29.1 μM); whereas none of the black dyes showed cytotoxicity at a highest concentration of 200 μM. The recorded decrease in viral replication in the presence of the drugs correlated with the reduced ability of Vero cells to capture iron, indicating the involvement of TfR1 in the antiviral activity of direct azo stains.
CONCLUSION: The study identified general patterns of direct azo dyes that are most active against SARS-CoV-2, i.e. approximately four acidic groups (sulfo groups) at the ends of the molecule and a small rigid flat linker (benzidine) connecting them. The findings open up prospects for the development of safe analogs of ferristatin II. In particular, benzidine may be replaced with less toxic tetramethylbenzidine and diaminoanthraquinone to reduce carcinogenic activity; to improve the structure, we propose to replace the sulfo groups with carboxyl groups.
Обоснование. Трансферриновый рецептор 1 (TfR1, CD71) является мультифункциональным белком, играющим важную роль в поддержании клеточного гомеостаза железа за счёт связывания с основным переносчиком железа — трансферрином (Tf). Помимо Tf, он способен связывать и переносить в клетку различные белки, вирусы, химиотерапевтические препараты и другие биомолекулы. Ранее был продемонстрирован эффект ингибирования инфекции SARS-CoV-2 при обработке клеток Vero ферристатином II — индуктором деградации TfR1; однако данный препарат не может быть использован как лекарственное средство ввиду образования канцерогенных производных бензидина при его метаболизме.
Цель исследования. Оценить противовирусную активность ряда азосоединений — структурных аналогов ферристатина II — с целью выявления общих структурных закономерностей соединений, демонстрирующих наибольшую эффективность против SARS-CoV-2. Полученные результаты будут использованы для разработки более безопасных аналогов ферристатина II, обладающих противовирусными свойствами.
Методы. В работе изучена противовирусная активность 15 соединений, 5 из которых были получены de novo методами органического синтеза. Противовирусную оценку препаратов проводили по их способности ингибировать репродукцию коронавируса SARS-CoV-2 линии Delta на культуре клеток Vero. Цитотоксичность соединений для данной клеточной линии определяли в МТТ тесте. Дополнительно для наиболее эффективных соединений была проведена оценка способности ингибировать захват железа клетками Vero с использованием хемосенсора HMRhoNox-M.
Результаты. Среди изученных красителей — аналогов ферристатина II — вирус-ингибирующей активностью обладали соединения прямой чёрный (среднеингибиторная концентрация IC50 = 53,7 мкМ), прямой зелёный (IC50 = 53,6 мкМ), прямой диазочёрный С (IC50 = 28,2 мкМ) и прямой чёрный 2К (IC50 = 45,3 мкМ). При этом соединение прямой зелёный проявляло выраженную токсичность для клеток Vero (CC50 = 29,1 мкМ), тогда как ни один из чёрных красителей не демонстрировал цитотоксичности при максимальной концентрации 200 мкМ. Данные о снижении репродукции вируса в присутствии препаратов коррелировали со снижением способности клеток Vero захватывать железо, что указывает на вовлечённость TfR1 в противовирусную активность прямых азокрасителей.
Заключение. Определены общие закономерности прямых азокрасителей, наиболее активных в отношении SARS-CoV-2: присутствие на концах молекулы порядка четырёх кислотных групп (сульфогруппы) и небольшого жёсткого плоского линкера (бензидина), соединяющего их. Полученные данные открывают перспективы для разработки безопасных аналогов ферристатина II; в частности, для минимизации канцерогенных свойств бензидин может быть заменён на менее токсичные тетраметилбензидин и диаминоантрахинон, а для оптимизации структуры предлагается заменить сульфогруппы на карбоксильные.