The effect of the oligodeoxynucleotide μ-ODN4084-F with anti-inflammatory properties on the development of opposite variants of chronic GVHD in the semi-allogeneic system DBA → (C57Bl6 x DBA)"

Full Text

«Влияние олигодезоксинуклеотида μ-ODN4084-F с антивоспалительными свойствами на развитие оппозитных вариантов хронической РТПХ в полуаллогенной системе DBA → (C57Bl6 x DBA)»

Н.Н. Вольский, Е.В. Гойман, Е.Н.Демченко, Е.Д. Гаврилова.

Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск, Россия

Введение

В последние три десятилетия активно изучалась структура и функции связанных с мембранами клеток млекопитающих толл-подобных рецепторных белков (TLR), обеспечивающих распознавание различных бактерий и вирусов с последующей активацией реакций врожденного иммунитета.  Эти исследования привели к выяснению того факта, что не только микробная ДНК, но и относительно небольшие олигодезоксинуклеотиды, содержащие в своей структуре повторяющиеся неметилированные CpG-фрагменты (CpG-олигонуклеотиды), являются лигандами TLR-9 и, следовательно, способны стимулировать развитие в организме воспалительных реакций благодаря воздействию на баланс Th1/Th2- лимфоцитов, (сдвиг в сторону доминирования Th1-активности).  Данное открытие привело к бурному развитию этого направления исследований, появлению значительного количества экспериментальных работ, в которых изучались свойства CpG-олигонуклеотидов и разрабатывались протоколы их применение для профилактики и борьбы с различными заболеваниями человека и животных [1, 2].

Параллельно с этим было обнаружено, что существуют олигонуклеотиды с противоположным эффектом, способные ингибировать воспалительные реакции, вызванные воздействием микробной ДНК или CpG-олигонуклеотидов [3]. В своей структуре они содержат определенные активные последовательности нуклеотидов, обусловливающие их супрессорную функцию, в частности, мотив TTAGGG, широко представленный в теломерах млекопитающих [4].  В обзоре, опубликованном в 2008 году [5], группа исследователей, активно занимавшихся изучением свойств таких олигонуклеотидов, констатировала, что о механизме действия, лежащем в основе их иммунорегуляторной активности, известно еще меньше, чем о соответствующих механизмах  эффектов CpG-олигонуклеотидов, и нельзя сказать, что в последующие годы ситуация радикально изменилась. Однако это не помешало появлению достаточно большого количества экспериментальных исследований, в которых изучались свойства этих олигонуклеотидов и возможности их использования в клинических целях [3, 5, 6]. Было, в частности, установлено, что важным следствием их действия является сдвиг Th1/Th2-соотношения, ведущий к подавлению Th1-зависимых реакций и стимулированию активности Th2-лимфоцитов [5].

Здесь стоит, видимо, отметить, что широко распространенное наименование таких олигонуклетидов как «иммуносупресивных» (или просто «супрессорных») может ввести в заблуждение, и в реальности у них не меньше оснований называться «иммуностимулирующими». Вызываемая ими иммуносупрессия касается только провоспалительных иммунных реакций, а ввиду существования реципрокных отношений между хелперами первого и второго типа, всякое подавление активности Th1-лимфоцитов неизбежно ведет к стимуляции Th2-зависимых реакций, и наоборот. Именно такое взаимоотношение между оппозитными вариантами иммунного ответа обусловливает возможность использования CpG-олигонуклеотидов для подавления аллергических реакций [7], а «иммуносупрессивных» олигонуклеотидов для стимуляции синтеза антител при иммунизации [6].

В ранее выполненных исследованиях in vitro [8] и на модели острой РТПХ in vivo [9] нами было показано, что олигонуклеотиды A151, ODN4084-F и μ-ODN4084-F обладают выраженными антивоспалительными свойствами благодаря вызываемому ими сдвигу Th1/Th2-баланса в сторону преобладания активности Th2-клеток. В ходе исследований этих олигонуклеотидов было установлено, что замена фосфата в их остове на фосфоротиоат повышает их устойчивость к действию сывороточных нуклеаз и может увеличивать их функциональную активность [3]. Кроме того показано [10], что замена нескольких фосфоротиоатных связей на мезильные значительно снижает цитотоксичность олигонуклетидов при сохранении их активности. В данной работе представлялось интересным исследовать влияние именно такого олигонуклеотида с мезильно-фосфоротиоатным остовом - μ-ODN4084-F, как  наиболее перспективного из вышеупомянутых олигонуклеотидов, в ранее разработанной и многократно испытанной в нашей лаборатории модели хронической РТПХ. 

Целью настоящей работы была проверка эффективности воздействия олигонуклеотида μ-ODN4084-F на сдвиг баланса Th1/Th2- лимфоцитов в целостном организме, оцениваемому по величине  его влияния на развитие разных вариантов хронической РТПХ в полуаллогенной системе DBA → (C57Bl6 x DBA).

Материалы и методы

Объект: В работе использованы мыши линии DBA/2 и мыши-гибриды (C57Bl/6xDBA/2)F₁ в возрасте 6 – 8 недель, полученных из Российского национального центра генетических ресурсов лабораторных животных на базе SPF-вивария ИЦиГ СО РАН (Новосибирск). Мыши получали комбикорм, сбалансированный по потребностям в белках, жирах, углеводах, витаминах, минеральных веществах и микроэлементах. Все эксперименты проводили в стандартных условиях содержания животных, соблюдения температурного режима, освещенности. Экспериментальные исследования выполнены в полном соответствии с требованиями Международной конвенции по гуманному обращению с подопытными животными.

Экспериментальная модель хронической РТПХ (хРТПХ): Введение мышам-гибридам (C57Bl/6xDBA/2)F₁ внутривенно по 120х10⁶ клеток селезенки мышей родительской линии DBA/2 [11]. Через 2,5 - 3 месяца от момента индукции модели - двукратное измерение уровня белка в моче: при протеинурии 3 мг/мл и более мышей относят к группе CКВнефрит+, при наличии белка в моче менее 3 мг/мл - к группе CКВнефрит-.

Дни забора материала в динамике – исход второй недели и три месяца.

Контрольные группы животных – аналогичные по полу, возрасту и подвергавшихся воздействию используемых препаратов в те же сроки и периоды как для опытных животных.

Введение ODN: в исследовании использованы два химически синтезированных олигонуклеотида с оппозитными эффектами, фосфатный модифицированный мезильной группой μ-ODN4084-F(ингибитор) и СpG-олигунуклеотид  класса SD-101(стимулятор). Вводили ODN трехкратно с момента индукции хРТПХ в дозе 25 мкг/мышь один раз в неделю, подкожно в объеме 200 мкл (0 день, 6 день, 13 день с момента переноса). Животным в контрольной группе вводили соответствующее количество физиологического раствора.

Выделение внеклеточной ДНК: Забор периферической крови для проведения анализа осуществлялся с помощью венозной пункции в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Плазму отделяли от форменных элементов центрифугированием при 400g в течение 20 мин. Выделение вкДНК из плазмы проводили на колонках компании «БиоСилика» (Новосибирск) согласно инструкции по применению «Набора для выделения ДНК из плазмы крови». Для определения вкДНК, связанной с клеточной поверхностью, клетки инкубировали 5 мин с 0,25% раствором трипсина, реакцию останавливали добавлением ингибитора трипсина из соевых бобов (Sigma, США) и центрифугированием отделяли супернатант, содержащий вкДНК. Определение ДНК проводили с помощью флюоресцентного красителя PicoGreen (Invitrogen, США). Концентрация ДНК пересчитывалась по калибровочной кривой, построенной для известных концентраций стандартной двухцепочечной λ-ДНК [11, 12].

Полученные данные по весу и клеточности лимфоидных органов приведены в виде средних величин параметров (мг и n × 10⁶/мл). Статистическую значимость различий между исследуемыми показателями оценивали с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни (Mann–Whitney U test).  Формирование баз данных для статистической обработки проводили с помощью Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft, США), статистическую обработку полученных результатов — с помощью программ Statistica 8.0 (Statsoft, США). Выявленные различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

 

Результаты

Как видно из рисунка 1, в описываемой серии экспериментов животные контрольной группы, у которых хРТПХ развивалась без каких-либо дополнительных воздействий, разделились в исходе патологического процесса на две равные доли: 50% - Th1-зависимый вариант развития хРТПХ (без нефрита) и 50% - Th2-зависимый с формированием иммунокомплексного люпус-подобного нефрита. В тоже время соотношение этих вариантов в группе, в которой мышам при индукции хРТПХ вводили олигонуклеотид μ-ODN4084-F, оказалось существенно иным. Как видно, лишь у двух мышей из тринадцати (15%) развился Th1-зависимый вариант развития хРТПХ, а у остальных 85% было диагностировано наличие выраженного поражения почек, характерное для Th2-зависимого варианта этого иммунопатологического процесса.

 

Рис. 1. Влияние олигонуклеотидов на развитие Th1- и Th2-зависимых вариантов   хронической РТПХ

 

Параллельно с описанным выше эффектом исследуемого олигонуклеотида на Рис. 1 представлен результат воздействия на ту же тест-систему олигонуклеотида SD101, содержащего несколько CpG-последовательностей, связывающегося с TLR-9 и обладающего  значительным провоспалительным эффектом [1, 7, 13]. Видно, что, как и следовало ожидать, эффект SD101 прямо противоположен эффекту μ-ODN4084-F: в группе с воздействием этого CpG-олигонуклеотида не наблюдалось ни одного случая возникновения нефрита, а у всех животных сформировался Th1-зависимый вариант хРТПХ.

На рисунке 2 представлена динамика развития спленомегалии в исследованных группах подопытных животных.

 

Рис. 2. Влияние олигонуклетидов на вес и клеточность селезенки у исследованных мышей в процессе развития хРТПХ.

Примечание: Данные представлены в виде процентов от средних величин измеряемых параметров в группе интактных животных (вес – 80,4 мг, клеточность – 102,9 х 10⁶ клеток).

Группы: 1 – интактные мыши;  2 – хРТПХ;  3 – хРТПХ + SD101;  4 – хРТПХ + μ-ODN4084-F;  5 – хРТПХ;  6 – хРТПХ + SD101;  7 – хРТПХ + μ-ODN4084-F

* - достоверность отличий от интактных животных (p < 0,05)

# - достоверность отличий от контрольной группы с хРТПХ через три месяца после индукции заболевания (p < 0,01)

 

Видно, что через две недели после индукции хРТПХ вес селезенки и содержание в ней клеток резко возрастают как в контрольной группе, так и в группах с введением оппозитно действующих олигонуклеотидов. Через три месяца после момента индукции, в результате формирования оппозитных вариантов  хРТПХ соотношение между группами стало существенно иным. В контроле и в группе с введением μ-ODN4084-F параметры селезенки несколько снизилась по отношению к величинам, наблюдавшимся на более раннем этапе заболевания, хотя остались заметно увеличенными по сравнению с интактными животными. В то же время в группе с введением CpG-олигонуклеотида величина и клеточность селезенки резко снизились в сравнении как с контрольной группой, так и с величиной этих параметров у интактных животных.

В разных группах с хРТПХ и у интактных мышей было измерено содержание внеклеточной ДНК (вкДНК) в периферической крови – показателя, заметно возрастающего при воспалительных процессах и, возможно, зависящего от состояния Th1/Th2-баланса в организме [11, 12]. Определялось количество вкДНК, как содержащейся в плазме крови, так и ковалентно связанной с мембранами клеток крови и переходящей в раствор только после кратковременной обработки трипсином (вкДНК, связанная с мембранами клеток). Результаты этих измерений представлены на Рис. 3. 

 

Рис. 3. Содержание вкДНК в крови животных с оппозитными вариантами развития хРТПХ

Примечание: Группы:  1 – интактные животные, 2 – мыши с Th1-зависимым вариантом хРТПХ,  3 – мыши с Th2-зависимым вариантом хРТПХ

      - вкДНК в  плазме крови

  - вкДНК, связанная с мембранами клеток

 - общее содержание вкДНК в крови

 * - достоверность отличий от интактных мышей (p < 0,05)

# - достоверность отличий от мышей c Th1-зависимым вариантом  хРТПХ (p < 0,05)

 

 Мыши были разделены на две группы, соответственно сформировавшемуся у них Th1- или Th2-зависимому варианту хРТПХ. (вне зависимости от природы воздействовавшего на них олигонуклеотида). Видно, что показатели уровня вкДНК в крови ведут себя в этих группах совершенно по-разному. В то время как у мышей с Th1-зависимым вариантом хРТПХ среднее количество вкДНК несколько снижается по сравнению с интактными животными (снижение относительно невелико – 15 – 25%, но статистически достоверно), у мышей с оппозитным вариантом заболевания оно явно возрастает (хотя из-за выраженного разброса данных различия с группой интактных мышей не достигают степени статистической достоверности). При сравнении же двух представленных на Рис. 3 групп мышей с хРТПХ между собой оказалось, что средние значения измеренных параметров в группе с Th2-зависимым вариантом в два с лишним раза превышают аналогичные показатели в оппозитной группе и различия статистически достоверны.

В отдельном эксперименте на интактных животных (мышах линии C57Bl/6) было установлено, что при отсутствии стимулированного иммунопатологического процесса трехкратное введение μ-ODN4084-F не приводит к заметному изменению содержания вкДНК в крови (данные не приведены).

 

Обсуждение

Ранее, в серии экспериментов, в которых в качестве тест-системы использовалось развитие острой РТПХ, нами было установлено [9], что введение подопытным мышам этого олигонуклеотида вызывает сдвиг Th1/Th2-баланса в сторону увеличения активности Th2-лимфоцитов и тем самым снижает степень деструкции лимфоидных органов, вызванной развитием Th1-зависимого иммунопатологического процесса. Очевидно, что представленный на Рис. 1 результат, полученный в тест-системе с хРТПХ, полностью подтверждает сделанный в нашей предыдущей работе вывод о наличии у μ-ODN4084-F выраженного антивоспалительного эффекта за счет  активации Th2-клеток и, таким образом, его воздействия на величину Th1/Th2-соотношения в организме. Здесь же следует отметить, что как показало специально проведенное на мышах линии C57Bl6 исследование, введение данного олигонуклеотида интактным животным не приводит к каким-либо изменениям веса лимфоидных органов (тимуса и селезенки) и не влияет на содержание лейкоцитов в их периферической крови (данные не приведены).

Механизм действия μ-ODN4084-F на иммунные реакции в настоящее время неизвестен, но в литературе имеются данные о том, что олигонуклеотиды сходного состава обладают антивоспалительными свойствами благодаря их ингибирующему влиянию на сигнальные пути IFN-g и IL-12 - цитокинов, играющих центральную роль в развитии Th1-зависимых иммунных процессов [14]. Нами было обнаружено [8], что μ-ODN4084-F обладает способностью эффективно ингибировать пролиферацию лимфоцитов в культуре in vitro и продукцию этими клетками IL-12, индуцированные воздействием стандартного CpG-олигонуклеотида, что можно объяснить связыванием тестируемого нами олигонуклеотида с TLR-9 и, соответственно, с конкурентным ингибированием эффектов CpG-лигандов этого рецептора, активация которого инициирует Th1-зависимые иммунные реакции. Надо надеяться, что дальнейшие исследования позволят более детально и адекватно описать механизмы действия μ-ODN4084-F и аналогичных агентов в условиях in vivo.

Стимулирующий эффект CpG-олигонуклеотида в использованной здесь полуаллогенной системе DBA → (C57Bl6 x DBA) был описан ранее [13]. Авторы данной работы сделали верный вывод о вызванном CpG-олигонуклеотидом сдвиге Th1/Th2-баланса в сторону преобладания Th1, подтверждаемом увеличением продукции IFN-g и снижением IL-4, а также возрастанием в крови титров антител IgG2a-класса, синтез которых находится под контролем Th1-клеток. Не предполагая существования двух оппозитных вариантов развития хРТПХ, они расценили уменьшение степени поражения почек как терапевтический эффект использованного ими агента, если и не предотвращающего развитие иммунопатологического процесса, вызванного введением лимфоцитов донора, то, по крайней мере, значительно уменьшающего выраженность проявлений иммунного конфликта у подопытных животных. Однако в реальности исчезновение симптомов нефрита и формирование Th1-зависимого варианта хРТПХ нельзя рассматривать как эффект терапии в полном смысле этого слова, поскольку данный вариант заболевания сопровождается тяжелейшим иммунодефицитом и другими нарушениями функционирования иммунной системы [15].

Увеличение селезенки (спленомегалия) является непременным симптомом развития как острой, так и хронической РТПХ. Особенно важен этот признак для хРТПХ, так как отражает интенсивность поликлональной активации и пролиферации В-клеток – важнейшего патогенетического механизма формирования иммунокомплексного гломерулонефрита и других поражений тканей при этом заболевании.

Согласно приведенным данным (рис.2), можно считать, что использованные в наших опытах иммуномодулирующие агенты в момент своего воздействия (детекция через 2 недели после индукции хРТПХ) не влияют радикально на вес и клеточность селезенки (показатели глубины иммунопатологических процессов), но небольшие различия все же наблюдаются. Так вес селезенки под влиянием обоих олигонуклеотидов увеличивался в несколько меньшей степени, чем в контрольной группе, а увеличение клеточности отличалось не только от контроля, но и между группами с введением разных олигонуклеотидов.

Формирование оппозитных вариантов хРТПХ (три месяца с момента индукции) существенно изменяет соотношение определяемых параметров – в группе с введением CpG-олигонуклеотидов снижены вес и клеточность по сравнению с контрольной группой и с группой интактных животных.

Механизм этого эффекта SD101 невозможно объяснить непосредственным воздействием олигонуклеотида на В-лимфоциты. Во-первых, несмотря на фосфоротиоатный остов олигонуклеотида, обеспечивающий большую устойчивость к сывороточным нуклеазам, к моменту регистрации уменьшения селезенки он не мог сохраниться в крови подопытных животных в неизменном виде, а значит определяющее данный эффект воздействие проходило на более ранней стадии развития хРТПХ. Во-вторых, как было обнаружено в опытах in vitro [8], этот олигонуклеотид не только не тормозит размножение лимфоцитов, но и является мощным индуктором их пролиферации, но надо заметить, что в данном случае снижение идет относительно значительного увеличения параметров после индукции хРТПХ. Таким образом, из представленной на рис.2 картины, по нашему мнению, можно сделать выводы о влиянии введенных олигонуклеотидов на конечный результат хРТПХ на достаточно раннем этапе формирования вариантов заболевания. А также, о специфичности воздействия олигонуклеотидов на развитие данной иммунологической реакции, о чем свидетельствует получение двух отличающихся друг от друга конечных вариантов развития хРТПХ  при использовании олигонуклеотидов с разными нуклеотидными последовательностями. Затруднительно связать воздействие SD101 на размеры селезенки в опытах in vivo c его способностью инициировать развитие Th1-зависимого варианта хРТПХ, поскольку в контрольной группе величина селезенки через три месяца развития хРТПХ была увеличена как у животных с Th2-зависимым вариантом заболевания, так и с Th1-зависимым вариантом (вес – 176 и 209 мг, клеточность – 130 и 159 х 10⁶ клеток, соответственно). В настоящий момент у нас нет возможности сформулировать какое-либо разумное предположение о механизме столь парадоксального воздействия CpG-олигонуклеотида на лимфоциты при развитии хРТПХ, и этот вопрос требует дальнейших исследований, в частности, желательно выяснить опосредуется ли данный эффект связыванием олигонуклеотида с TLR-9.

В серии экспериментов во всех группах с хРТПХ и у интактных мышей был измерен показатель, как уже упоминалось выше, заметно возрастающий в периферической крови при воспалительных процессах и, вероятно, зависящего от состояния Th1/Th2-баланса в организме - уровень внеклеточной ДНК (Рис 3). Полученные результаты, можно, с одной стороны, считать убедительным и основанным на независимой серии экспериментов подтверждением вывода, сделанного нами ранее [11] о том, что увеличение содержания вкДНК в крови не объясняется непосредственной связью со сдвигом Th1/Th2-соотношения в сторону преобладания активности Th1-лимфоцитов, а связано с этим фундаментальным параметром иммунной системы лишь через его влияние на развитие воспалительных процессов в организме. Об этом говорит отсутствие повышенных количеств вкДНК в крови у мышей с Th1-зависимым вариантом хРТПХ и резко увеличенные значения этого показателя у животных с наличием активного воспаления в почечной ткани, вызванного массивным отложением в ней иммунных комплексов [15]. В пользу связи изменений уровня вкДНК в крови с активностью воспаления в использованной нами модели говорит и то, что содержание вкДНК в плазме крови достаточно хорошо коррелирует (ρ = 0,40; p < 0,05) с концентрацией белка в моче животных с хРТПХ, то есть с показателем прямо отражающим интенсивность воспалительного процесса в почках.

С другой стороны, обнаруженную связь можно объяснять и несколько по-иному. В литературе имеется ряд экспериментальных работ, в которых было показано, что ДНК млекопитающих способна ингибировать активацию воспалительных реакций, вызванную микробной ДНК и CpG-олигонуклеотидами [4, 5, 16]. Правда, роль этого феномена в регуляции реальных иммунопатологических процессов в организме животных еще практически не исследована, и это дело будущего. Однако можно предположить, что наблюдаемая связь между воспалительными реакциями и изменениями содержания вкДНК в крови обусловлена стремлением регуляторных систем организма ограничить выраженность воспалительного процесса благодаря увеличенному воздействию собственной вкДНК на TLR-9. Это могло бы объяснить и наличие специфической антивоспалительной активности у синтетических олигонуклеотидов, копирующих определенные нуклеотидные последовательности ДНК млекопитающих.

Принимая во внимание все полученные результаты, можно сказать, что наличие у сравниваемых олигонуклеотидов оппозитных эффектов в данной тест-системе хорошо согласуется с данными, полученными в других экспериментальных условиях.  

 

Заключение

Эксперименты in vivo, выполненные с использованием модельной хРТПХ, убедительно свидетельствует об имеющейся у олигонуклеотида μ-ODN4084-F способности специфически активировать Th2-зависимые иммунные реакции в ответ на антигенную стимуляцию, сдвигая Th1/Th2-соотношение в целостном организме и подавляя таким образом развитие воспалительных процессов. Надо надеяться, что дальнейшие исследования позволят более детально и адекватно описать механизмы действия μ-ODN4084-F и аналогичных агентов в условиях in vivo. Данное исследование делает возможным использование иммуносупрессорного олигонуклеотида μ-ODN4084- и подобных   ему олигонуклеотидов в качестве эффективных агентов при коррекции различных нарушений функционирования иммунной системы и может быть положено в основу разработки их применения, как при экспериментальных исследованиях, так и для профилактики и лечения нарушений деятельности иммунной системы в клинике.

Дополнительная информация

Благодарность: Авторы выражают благодарность Е.А. Бураковой (ИЦиГ СО РАН, Новосибирск) за синтез используемых в исследовании олигонуклеотидов.

Источник финансирования. Исследование проведено за счёт средств федерального бюджета для выполнения государственного задания на научно-исследовательскую работу (РК №  124112700049-9 ).

 

Этическая экспертиза. Исследование одобрено локальным этическим комитетом НИИФКИ (протокол № 92 от 10.11.2015).

 

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Н.Н. Вольский — статистическая обработка и анализ результатов, написание черновика текста статьи; Е.Н. Демченко — сбор и обработка биологического материала, обсуждение материалов; Е.В. Гойман — сбор и обработка биологического материала, оформление ссылок и таблиц; Е.Д. Гаврилова — концепция и дизайн исследования, анализ и обсуждения данных, редактирование статьи.

 

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали

 

Additional information

Acknowledgments: The authors express their gratitude to E.A. Burakova (Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Novosibirsk) for the synthesis of the oligonucleotides used in the study.

Funding source. The study was carried out at the expense of the federal budget to fulfill the state assignment for research work  (No.  124112700049-9).

 

Ethics approval: The study was approved by the Local Ethics committee of the Research Institute of Physical Culture and Sports Medicine (Protocol No. 92 dated November 10, 2015).

 

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work). N.N. Volskiy — statistical processing and analysis of results, writing the text of the article; E.N. Demchenko — collection and processing of biological material, discussion of materials; E.V. Goiman — collection and processing of biological material, preparation of links and tables; E.D. Gavrilova — concept and design of the study, data analysis and discussion, article editing.

 

Disclosure of interests. The authors declare no obvious or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Originality. The authors did not use previously published information (text, illustrations, or data) in the creation of this work.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

 

About the authors

Nikolay N. Volskiy

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: dtheory@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9341-1997
SPIN-code: 6089-5244

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Novosibirsk

Elena V. Goiman

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: l.goiman@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6443-6917
SPIN-code: 6886-9372

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Novosibirsk

Elena N. Demchenko

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: elena.demchenko@gmail.com
ORCID iD: 0009-0001-5178-5616
SPIN-code: 2269-1820

Cand. Sci. (Chemistry)

Russian Federation, Novosibirsk

Elena D. Gavrilova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Author for correspondence.
Email: edav.gavr@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2014-3397
SPIN-code: 7062-5818

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Novosibirsk

References

Supplementary files