Development and in vitro biological activity assessment of IgA1 and IgG1 isotypes of the universal anti-influenza A antibody FM08

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Ежегодные эпидемии, вызываемые вирусом гриппа А штаммов H1N1 и H3N2 и вирусом гриппа В, приводят примерно к 1 млрд случаев инфицирования, 3–5 млн случаев тяжёлой формы заболевания, требующей госпитализации, и до 0,5 млн летальных исходов по всему миру [1].

Современная стратегия противодействия гриппу в значительной степени опирается на вакцинопрофилактику. Тем не менее в связи со спорадическим появлением штаммов вируса гриппа, устойчивых к противовирусным препаратам, а также отсутствием универсальных вакцин актуальной задачей становится разработка альтернативных подходов к лечению. Одним из наиболее перспективных направлений считается использование моноклональных антител широкого спектра действия [2].

За последнее 10-летие из В-клеток памяти вакцинированных или переболевших пациентов были идентифицированы новые противогриппозные моноклональные антитела [3–6], которые способны нейтрализовать широкий спектр штаммов вируса гриппа.

Большинство вируснейтрализующих антител против гриппа связываются с глобулярной головкой гемагглютинина (HA) вируса и распознают гомологичные штаммы в пределах данного подтипа [3, 7]. Связываясь с антигеном, такие антитела блокируют (делают недоступным) взаимодействие вируса с его рецептором ― сиаловой кислотой на поверхности клетки, что препятствует интернализации вируса [7]. Существует другой тип антител, также обладающих широкой специфичностью и нейтрализующей активностью, направленных на стволовой домен HA вируса гриппа, содержащий пептид слияния. Такие антитела способны блокировать расщепление белка слияния и предотвращать формирование требуемой для инфицирования конформации HA [8]. Прямое нейтрализующее действие антител, направленных к стволу HA, менее выражено по сравнению с антителами, мишенью которых является глобулярный участок HA, но, как было показано, такие антитела [3, 5, 9] индуцируют сильную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) инфицированных клеток как in vitro, так и in vivo.

Известно, что эффекторные свойства антитела зависят от структуры входящей в его состав тяжёлой цепи, определяющей класс антитела [10]. В зависимости от класса — IgG, IgA, IgM, IgD или IgE — иммуноглобулины способны взаимодействовать с разным набором иммунных клеток и в разной степени проявлять Fc-зависимые функции [11], такие как антителозависимый клеточный фагоцитоз, трогоцитоз, ADCC, нетоз и т. п. [12]. Усовершенствования дизайна и вариантов применения могут сделать рекомбинантные антитела (рАТ) ключевым инструментом в борьбе с гриппом [13].

В рамках данного исследования были получены иммуноглобулины в двух форматах — IgG1- и IgA1-изотипов (мономерная форма) — на основе описанных в литературе вариабельных участков нейтрализующего антитела широкого спектра действия FM08 (MEDI8852), направленного к стволовому домену HA, а также изучены их биологические свойства in vitro [5]. Исследование R.M. Mallory и соавт. [14] продемонстрировало безопасность и хорошую переносимость однократного внутривенного введения препарата на основе рАТ MEDI8852 у здоровых людей, что является обоснованием для его дальнейшей разработки в качестве терапевтического средства для профилактики и лечения гриппа. Последовательности вариабельных областей тяжёлой и лёгкой цепей FM08 находятся в открытом доступе [5].

Цель

Получить и оценить свойства, специфичность и вируснейтрализующую активность рАТ FM08, направленного против стволового домена гемагглютинина вируса гриппа A, в формате IgA1 и IgG1.

МЕТОДЫ

Накопление рекомбинантных антител IgA1- и IgG1-изотипов

Исследование проведено в период с 01.02.2025 по 30.11.2025. Клетки линии НЕК293 культивировали в среде DMEM (Биолот, Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров (Gibco, США), истощённой на сорбенте с белком А, в СО₂-инкубаторе при 37 ℃ во влажной атмосфере, содержащей 6% СО₂. Для проведения трансфекции клетки засевали в культуральные флаконы площадью 175 см² (Jet Biofil, Китай) с целью достижения суточного 100% монослоя, после чего трансфицировали с помощью трансфекционного реагента GenJect-39 (Молекта, Россия) согласно инструкции производителя. Трансфекцию проводили из расчёта 40 мкг плазмидной ДНК (суммарно кодирующей тяжёлые и лёгкие цепи антитела) на один культуральный флакон при соотношении ДНК : трансфекционный реагент 1:1 (м/о). Клетки после трансфекции культивировали в течение 12 сут, поддерживая концентрацию глюкозы не менее 6 г/л.

Хроматографическая очистка рекомбинантных антител

Хроматографическую очистку рАТ проводили методом аффинной хроматографии с помощью хроматографической системы AKTA pure (Cytiva, США) на колонке KappaSelect (1 мл, Cytiva, США) объёмом 1 мл (Sepax, Китай). Колонку промывали 10 CV (объём колонки, column volume) стартового буфера (1× PBS) при скорости потока 1 мл/мин. 50 мл культуральной жидкости, предварительно профильтрованной через шприцевой фильтр Sartorius (размер пор — 0,45 мкм, материал мембраны — полиэфирсульфон), вносили в хроматограф через насос для ввода образцов на скорости потока 0,5 мл/мин. Далее колонку промывали 10 CV стартового буфера при скорости потока 1 мл/мин. Антитела элюировали 100% элюирующим буфером (20 мМ глицин, pH 3.0) в объёме 15 CV на скорости потока 1 мл/мин. Мониторинг осуществляли по оптическому поглощению на длине волны 280 нм. На этапе элюции при помощи автоматического коллектора фракций отбирали пик с оптической плотностью выше 0,05 AU. К собранному материалу добавляли 1 М раствор Tris-HCl (pH 8.8, 20 мкл на 1 мл) и 4 М раствор хлорида натрия (40 мкл на 1 мл). Для увеличения стерильности и предупреждения деградации и контаминации полученный препарат фильтровали при помощи шприцевого фильтра Sartorius (размер пор — 0,45 мкм, материал мембраны — полиэфирсульфон) и использовали для дальнейших исследований.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле

Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ЭФ-ПААГ) проводили по методу Лэммли [15] в восстанавливающих (в присутствии β-меркаптоэтанола) и невосстанавливающих условиях. Использовали 10-луночный градиентный предзалитый гель Any kD (Bio-Rad, США). Перед нанесением образца в лунки ПААГ его смешивали с четырёхкратным буфером Лэммли, после чего проводили денатурацию белка при 95 °C в твёрдотельном термостате «Гном» (ДНК-Технология, Россия) в течение 10 мин (восстанавливающие условия). В каждую лунку вносили по 1–5 мкг образца белка. Концентрацию белков оценивали на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, США). Для антител использовали режим IgG, при котором значение E 1%=13,70. Электрофоретическое разделение белков проводили при постоянной силе тока (40 мА на гель) в течение 45 мин в вертикальной электрофоретической ячейке Mini-PROTEAN Tetra (Bio-Rad, США). Окрашивание геля выполняли коллоидным раствором Кумасси. Изображение окрашенного геля получали на гель-документирующей станции Gel Doc EZ Imager (Bio-Rad, США).

Проверка связывания и специфичности рекомбинантных антител методом непрямого иммуноферментного анализа

Для проведения непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) вирусным материалом, разведённым в фосфатно-солевом буфере (PBS) до нужной концентрации (обычно до 2 мкг/мл), сенсибилизировали лунки 96-луночного планшета Microlon High Binding (#655061, Greiner Bio-One, Германия) в объёме 100 мкл на лунку и инкубировали при температуре 4 °C в течение ночи (12–18 ч). После этого проводили отмывку в приборе BioTek 405 TS Washer (Agilent Technologies, США) путём удаления содержимого лунок и трёхкратной отмывки несвязавшихся компонентов внесением однократного раствора PBS-T (PBS с добавлением Tween 20 до 0,05%) по 300 мкл в лунку с последующим удалением раствора. Далее сорбирующую поверхность лунок блокировали 5% раствором сухого обезжиренного молока (Blotting-Grade Blocker, #1706404, Bio-Rad, США) в однократном PBS-T (далее «блокирующий реагент») при температуре 37 °C в течение 1 ч и проводили отмывку. Затем в лунки микропланшета вносили тестируемые рАТ в объёме 100 мкл в концентрации от 2 мкг/мл до 4 нг/мл, разведённые на блокирующем реагенте, инкубировали при температуре 37 °C в течение 1 ч и проводили отмывку. Связавшиеся с антигеном антитела детектировали с помощью пероксидазного конъюгата IgG GAH-HRP (#1721033, Bio-Rad, США) или IgA GAH-HRP (#А0295, Sigma-Aldrich, США), разведённого 1 к 1000 на блокирующем реагенте, при температуре 37 °C в течение 1 ч, по 100 мкл в лунку. Далее проводили отмывку и проявляли пероксидазную реакцию добавлением в каждую лунку 100 мкл субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) (#R055, Хема, Россия). После остановки цветной реакции добавлением в каждую лунку по 100 мкл 2Н H₂SO₄ измеряли оптическую плотность на длинах волн 450 нм (OD₄₅₀) и 620 нм (OD₆₂₀) на микропланшетном ридере Multiskan SkyHigh (Thermo Fisher Scientific, США). Дальнейшую обработку результатов проводили с использованием программ Microsoft Office Excel и GraphPad Prism 6. Для учёта фонового сигнала сначала находили разницу соответствующих величин оптической плотности OD₄₅₀ и OD₆₂₀ для каждой лунки. В качестве порогового значения (limit of detection, LOD) брали среднее значение (mean value) по всем отрицательным контролям (лунки с растворителем PBS-T) плюс три стандартных отклонения (SD) данной величины.

Реакция микронейтрализации

Реакцию микронейтрализации проводили по стандартной методике, рекомендуемой Всемирной организацией здравоохранения¹. Для этого готовили последовательные двукратные разведения антитела в питательной среде α-MEM (#1.3.9.1., Биолот, Россия), смешивали с равным объёмом вируса, содержащего 100 ТИД₅₀/50 мкл, и инкубировали при 37 °C в течение 1 ч. Вируссодержащую жидкость разводили до нужной концентрации в той же среде с добавлением 1 мкг/мл трипсина, обработанного TPCK (#T1426, Sigma-Aldrich, США), и 1% антибиотика-антимикотика (#152400, Gibco, США). Далее смесь переносили на суточный монослой клеток почки собаки Мадина– Дарби (MDCK). Клетки культивировали в среде α-MEM с добавлением 2 мМ L-глутамина и 10% эмбриональной сыворотки коров (Биолот, Россия) в 96-луночном планшете (по 100 мкл в лунку) и инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 72 ч. Учёт развития инфекции проводили с помощью реакции гемагглютинации с использованием 0,5% суспензии куриных эритроцитов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для получения и накопления рАТ FM08 IgA1- и IgG1-изотипов вариабельные области тяжёлых и лёгких цепей FM08 были клонированы в высокоэкспрессионные векторы pcDNA3.4 и pIRESpuro3, предназначенные для накопления белков в эукариотических клеточных линиях. Константные участки тяжёлых цепей традиционно состояли из доменов CH1-hinge region-CH2-CH3, их аминокислотные последовательности были полностью идентичны описанным в базе данных UniProt [16] последовательностям P01857 для IgG1 и P01876 для IgA1 человека. Константная область лёгкой цепи, идентичная для обоих исследуемых изотипов рАТ FM08, полностью соответствовала последовательности каппа-цепи человека (UniProt P01834). Для секреции иммуноглобулина тяжёлые цепи обоих исследуемых изотипов содержали на N-конце сигнальную последовательность MEFGLSWVFLVALFRGVQC, а лёгкая — MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC, описанные ранее в литературе [17]. Схемы разработанных плазмид представлены на рис. 1, a.

 

Рис. 1. Конструирование и анализ рАТ FM08 изотипов IgA1 и IgG1. a — схемы плазмид, используемых для транзиентной экспрессии рАТ FM08 IgA1- и IgG1-изотипов. Карты созданы в программе UGENE [18]; b — результаты электрофореза белков в полиакриламидном геле рАТ FM08 IgG1- и IgA1-изотипов в восстанавливающих (+ β-МЭ) и невосстанавливающих (− β-МЭ) условиях. β-MЭ — β-меркаптоэтанол. М — маркёр молекулярных масс Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards (Bio-Rad, США). На дорожках в левой части геля видны полосы, соответствующие тяжёлой и лёгкой цепям рАТ FM08.

Fig. 1. Construction and characterization of IgA1 and IgG1 isotypes of FM08. a, Schematic representation of plasmids for transient expression of FM08 IgA1 and IgG1. The maps were created using the UGENE software [18]. b, Results of protein electrophoresis of the recombinant FM08 antibody (IgG1 and IgA1 isotypes) in a polyacrylamide gel under reducing (+ β-ME) and non-reducing (− β-ME) conditions. β-ME refers to β-mercaptoethanol. M is a molecular weight marker from the Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards kit (Bio-Rad, USA). The lanes on the left side of the gel show bands that are consistent with the heavy and light chains of FM08.

 

Биосинтез экспериментальных образцов рАТ FM08 обоих исследуемых изотипов был выполнен с использованием культуры адгезионных клеток HEK293 в режиме транзиентной экспрессии в бессывороточной среде. После хроматографической очистки препараты иммуноглобулинов анализировали методом ЭФ-ПААГ по методу Лэммли [15]. Для дальнейшей сравнительной оценки биологических свойств получено не менее 0,5 мг рАТ FM08 каждого изотипа (IgA1 и IgG1). Результаты ЭФ-ПААГ представлены на рис. 1, b. В восстанавливающих условиях для обоих образцов наблюдаются полосы около 50–55 кДа, соответствующие тяжёлым цепям, а также полосы около 25–27 кДа, соответствующие лёгким цепям иммуноглобулинов.

После анализа целостности и подтверждения молекулярной массы накопленных препаратов рАТ исследована их вирус-связывающая активность. Способность рАТ FM08 изотипов IgA1 и IgG1 связываться с вирусными антигенами была проанализирована методом ИФА. Для этого в качестве сорбирующих лигандов использована панель вирусов гриппа, содержащих различные подтипы поверхностных гликопротеинов HA и NA. Исследовано вирус-связывающее действие рАТ FM08 изотипов IgA1 и IgG1 с 13-ю штаммами вируса гриппа, два из которых относились к типу B. Согласно полученным нами результатам (рис. 2) оба изотипа рАТ FM08 имели практически идентичный паттерн связывания с исследуемыми вирусами, значения оптической плотности также были сопоставимы. Оба изотипа эффективно выявляли сезонные циркулирующие в настоящее время в человеческой популяции подтипы вирусов H1N1pdm и H3N2. Также наблюдался достаточно высокий сигнал связывания с подтипом H5N1, потенциально обладающим высоким пандемическим потенциалом, и H2N2. Примечательно, что рАТ FM08 не проявляло связывающей активности с вирусом гриппа H1N1 1934 года, что в целом сопоставимо с литературными данными [19]. Экспериментальные образцы рАТ FM08 изотипов IgA1 и IgG1 не связывали штаммы вируса гриппа В. Наблюдалась зависимость уровня сигнала детекции от количества рАТ, взятого в ИФА, при этом даже минимальная концентрация рАТ 16 нг/мл позволяла специфически детектировать вирус, с которым происходило связывание и при более высоких концентрациях.

 

Рис. 2. Результаты анализа связывания рАТ FM08 IgA1- и IgG1-изотипов при концентрации 1000 нг/мл (показана синим цветом), 125 нг/мл (зелёным цветом) и 16 нг/мл (красным цветом) с вирусами гриппа A и B. Столбцы отражают средние значения оптической плотности (ΔOD_450;620) по двум повторам ± стандартное отклонение (SD). Справа в таблице представлены полные названия штаммов и подтипы вирусов гриппа, использованных при сорбции. ВГ — вирус гриппа, ma — mouse adapted, штамм, адаптированный к мышам.

Fig. 2. The binding assay of the FM08 antibody of the IgA1 and IgG1 isotypes at concentrations of 1000 ng/mL (blue), 125 ng/mL (green), and 16 ng/mL (red) with influenza A and B viruses. The columns represent the mean optical density values (ΔOD_450;620) of two replicates ± standard deviation (SD). The table on the right lists the complete names and subtypes of the influenza viruses used in the sorption process. ВГ, the influenza virus, ma, mouse adapted.

 

Заключительный этап исследования был посвящён сравнительной оценке вируснейтрализующей активности рАТ FM08 изотипов IgA1 и IgG1. Исследована способность нейтрализовать рАТ FM08 инфекционные вирусы гриппа A/California/07/2009 (H1N1pdm09), A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1), A/Cambodia/e0826360/2020 (H3N2) in vitro на культуре пермиссивных клеток MDCK.

Детекцию степени ингибирования цитопатического действия вируса гриппа оценивали методом реакции гемагглютинации. По результатам построения кривой «доза — эффект» на основании трёх независимых повторов рассчитана 50% ингибирующая концентрация (IC₅₀) в отношении протестированных штаммов (рис. 3).

 

Рис. 3. Нейтрализующая активность рАТ FM08 изотипов IgA1 и IgG1. Определение титра нейтрализующих антител выполнено в трёх повторах, для каждой точки на графике представлено среднее значение процента ингибирования. В таблице под рисунком представлены рассчитанные значения IC₅₀.

Fig. 3. Neutralizing activity of the FM08 antibody of two isotypes, IgA1 and IgG1. The titer of neutralizing antibodies was determined in triplicate; the mean percentage of inhibition is presented for each point on the graph. The table below the figure shows the calculated IC₅₀ values.

 

Согласно полученным результатам рАТ FM08 изотипов IgA1 и IgG1 проявляли нейтрализующую активность в отношении эталонных штаммов вируса гриппа. Показатели IC₅₀ для вируса гриппа H1N1pdm в зависимости от изотипа варьировали в диапазоне 1–4 мкг/мл. Для вируса H3N2 значение IC₅₀ было больше — 20 мкг/мл. Значимых различий между полученными значениями IC₅₀ для рАТ FM08 IgA1- и IgG1-изотипов выявлено не было. Важно отметить, что для вируса H1N1 1934 года значение IC₅₀ определить не удалось (IC₅₀ >50 мкг/мл). Этот результат согласуется с отсутствием достоверного связывания рАТ FM08 изотипов IgA1 и IgG1 с данным штаммом в непрямом ИФА.

ОБСУЖДЕНИЕ

В то время как антигенная специфичность иммуноглобулина определяется вариабельными доменами, in vivo нейтрализация патогенов в значительной степени зависит от его Fc-опосредованных эффекторных функций. В настоящее время в качестве основы для терапевтических антител используют иммуноглобулины класса G [11]. Тем не менее показано, что эффективность антител класса IgA на слизистых оболочках, таких как эпителий дыхательных путей и кишечника, значительно выше, чем у IgG [20]. Таким образом, различия в Fc-опосредованных функциях иммуноглобулинов могут играть существенную роль в эффективности противовирусной терапии.

Наше исследование было посвящено получению, характеристике, а также сравнительной оценке биологической активности in vitro рАТ FM08 двух форматов — IgA1- и IgG1-изотипов. FM08 — это человеческое моноклональное антитело широкого спектра действия, направленное против HA вируса гриппа А обеих генетических групп [21]. Эффективная нейтрализация вируса гриппа достигается за счёт воздействия рАТ FM08 на начальные и завершающие этапы жизненного цикла вируса. В частности, FM08 связывается с аминокислотными остатками в гидрофобной бороздке домена слияния HA и стабилизирует его конформацию, ингибируя pH-опосредованное слияние вируса с эндосомой [2]. Известно, что антитела с такими свойствами менее эффективны при прямой нейтрализации вируса по сравнению с антителами, направленными к глобулярному домену HA, однако они обеспечивают защиту in vivo посредством Fc-зависимых эффекторных функций [8]. В 2025 году опубликовано исследование [22], посвящённое комбинаторной терапии гриппа препаратом, представляющим собой рАТ MEDI8852 (FM08), конъюгированное с ингибитором нейраминидазы занамивиром. Показано, что Fc-фрагмент человеческого иммуноглобулина IgG1-изотипа увеличил период полувыведения в кровотоке низкомолекулярного противовирусного препарата, обеспечив полную защиту мышей от летальной экспериментальной гриппозной инфекции.

Поэтому сравнительный анализ противовирусной активности разных изотипов одного моноклонального антитела представляет особую практическую ценность для выбора оптимальной лекарственной формы.

Нами были получены плазмидные конструкции для сборки рАТ FM08 IgA1- и IgG1-изотипов в эукариотических клетках. Каждое рАТ собрано с использованием двух плазмид, кодирующих тяжёлую и лёгкую цепи. При этом лёгкая цепь (а также кодирующая её плазмидная конструкция) являлась общей для обоих исследуемых изотипов и принадлежала к каппа-типу. Известно, что в соответствии с принципом аллельного исключения, каждый зрелый B-лимфоцит экспрессирует иммуноглобулины только с одним типом лёгкой цепи — либо каппа, либо лямбда. Принадлежность к тому или другому типу детерминируют константные каппа- и лямбда-домены лёгких цепей, которые функционально эквивалентны и не определяют специфичность антитела [23]. Мы выбрали каппа-цепь, поскольку исходное антитело, выделенное от пациента, содержало лёгкую цепь именно такого типа [24]. Кроме того, использование лёгкой каппа-цепи позволило унифицировать очистку рАТ FM08 IgA1- и IgG1-изотипов, поскольку оба изотипа могли быть очищены на одном аффинном носителе, специфичном к каппа-цепи.

Электрофоретический анализ очищенных препаратов рАТ FM08 изотипов IgA1 и IgG1 подтвердил наличие полос, соответствующих по молекулярной массе тяжёлой и лёгкой цепям иммуноглобулинов. При электрофорезе в восстанавливающих условиях под действием β-меркаптоэтанола рАТ диссоциируют на тяжёлые (~50 кДа) и лёгкие (~25 кДа) цепи, что согласуется с теоретически предсказанными значениями. В невосстанавливающих условиях рАТ FM08 IgG1-изотипа мигрировали в геле в виде единого гетеротетрамера, а рАТ FM08 IgA1-изотипа — в виде двух полос, что может быть связано с артефактами ПААГ и неприменимостью метода Лэммли для анализа целостности и чистоты препаратов иммуноглобулинов в нативных условиях (оба экспериментальных образца рАТ FM08 мигрируют выше маркёра размером 250 кДа, тогда как их ожидаемая молекулярная масса составляет не более 150–170 кДа). Следует отметить, что в работе была получена только мономерная форма рАТ FM08 изотипа IgA1. Известно, что в сыворотке крови IgA присутствует главным образом в мономерной форме, хотя также обнаруживаются димерные (dIgA) и полимерные (pIgA) формы, которые преимущественно секретируются на слизистых оболочках [25]. В кровотоке преобладают иммуноглобулины класса G, способные взаимодействовать с Fc-рецепторами на поверхности иммунных клеток, запуская тем самым реализацию их эффекторных функций, в то время как на слизистых оболочках основную роль играет секреторный IgA, который обеспечивает первую линию защиты за счёт иного механизма — нейтрализации патогенов и их элиминации, что делает IgA ключевым фактором защиты на входных воротах инфекции [26].

Нами показано, что оба исследуемых изотипа рАТ FM08 высокоэффективно связывали штаммы вируса гриппа А, относящиеся к обеим генетическим группам, разделяющимся по подтипам HA. Генетически существует 18 подтипов HA вируса гриппа А, которые образуют группу 1 (H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, H18) и группу 2 (H3, H4, H7, H10, H14, H15) [27, 28]. Антитела, полученные в результате вакцинации или заражения, нейтрализуют в первую очередь гомологичные штаммы вируса гриппа. Антитела широкого спектра действия, способные нейтрализовать несколько подтипов вируса из разных генетических групп, обладают высоким терапевтическим потенциалом.

В завершение мы подтвердили гетеросубтипичную нейтрализующую активность обоих исследуемых изотипов полученного нами рАТ FM08 в отношении вируса гриппа подтипов H1N1pdm и H3N2. Показано, что рАТ FM08 как изотипа IgA1, так и изотипа IgG1 эффективно нейтрализует вирусы гриппа A/California/07/2009 (H1N1pdm09) и A/Cambodia/e0826360/2020 (H3N2) и предотвращает инфицирование клеток MDCK вирусами гриппа A. Значения IC₅₀, полученные in vitro для рАТ FM08 обоих исследуемых изотипов, являются сопоставимыми и типичными [5] для препаратов с высокой противовирусной активностью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, нами получены экспериментальные образцы рАТ IgA1- и IgG1-изотипов, содержащие вариабельные домены моноклонального антитела человека FM08. Для этого проведён дизайн плазмид, кодирующих тяжёлые и лёгкие цепи исследуемых иммуноглобулинов, их экспрессия в эукариотических системах и последующая очистка. При тестировании in vitro экспериментальные препараты рАТ проявили выраженную противовирусную активность, что указывает на их высокий терапевтический потенциал. Получение рАТ широкого спектра действия против консервативных эпитопов белков вируса гриппа создаёт перспективу для разработки универсальных терапевтических и профилактических препаратов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Д.А. Фалалеева — проведение исследования, анализ данных, написание черновика рукописи; В.С. Монахова — проведение исследования, анализ данных; М.А. Плотникова — разработка методологии, проведение исследования, анализ данных, визуализация, написание черновика рукописи; В.А. Олейник — проведение исследования, анализ данных; Е.А. Романовская-Романько — проведение исследования, анализ данных, написание черновика рукописи; С.А. Клотченко — определение концепции, руководство исследованием, привлечение финансирования, пересмотр и редактирование рукописи. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Этическую экспертизу протокола исследования не проводили. Основание — исследование не предполагало участие людей или лабораторных животных.

Источники финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации (регистрационный номер НИОКТР в ЕГИСУ НИОКТР 124021200034-5).

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Редакционная политика в отношении совместного использования данных к настоящей работе неприменима, новые данные не собирали и не создавали.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два члена редакционного совета.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: D.A. Falaleeva: investigation, formal analysis, writing—original draft; V.S. Monakhova: investigation, formal analysis; M.A. Plotnikova: methodology, investigation, formal analysis, visualization, writing—original draft; V.A. Oleinik: investigation, formal analysis; E.A. Romanovskaya-Romanko: investigation, formal analysis, writing—original draft; S.A. Klotchenko: conceptualization, supervision, funding acquisition, writing—review & editing. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: The study protocol was not reviewed by an ethics committee. Reason: the study did not involve human or laboratory animal participants.

Funding sources: This work is part of the State Assignment of the Ministry of Health of the Russian Federation (R&D Registration No. 124021200034-5 in the Unified State Information System for Accounting of Research, Development, and Technological Work (EGISU NIOKTR)).

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: The editorial policy regarding data sharing does not apply to this work, and no new data was collected or created.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved two members of the editorial council.

 

¹ World Health Organization. Serological diagnosis of influenza by microneutralization assay. В: World Health Organization [Internet]. Geneva, Switzerland, 2010. Режим доступа: https://www.who.int/publications/i/item/serological-diagnosis-of-influenza-by-microneutralization-assay Дата обращения: 24.12.2025.

About the authors

Daria A. Falaleeva

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Email: f.daria@list.ru
ORCID iD: 0009-0002-6769-7044
SPIN-code: 3812-8607
Russian Federation, Saint Petersburg

Varvara S. Monakhova

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Email: varvara.bio@gmail.com
ORCID iD: 0009-0002-9519-5316
SPIN-code: 2111-8493

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Marina A. Plotnikova

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Email: biomalinka@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8196-3156
SPIN-code: 2986-9850

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Veronika A. Oleinik

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Email: working.lyutik@gmail.com
ORCID iD: 0009-0005-3081-0463
SPIN-code: 1299-6388
Russian Federation, Saint Petersburg

Ekaterina A. Romanovskaya-Romanko

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Email: romromka@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7560-398X
SPIN-code: 1012-8043

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Sergey A. Klotchenko

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Author for correspondence.
Email: fosfatik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0289-6560
SPIN-code: 2632-6195

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files