EFFECT OF LACTATE IN VITRO ON PHAGOCYTIC AND CHEMILUMINESCENT ACTIVITY OF NEUTROPHILS IN SEPSIS

Full Text

Обоснование

На сегодняшний день сепсис остаётся одной из ведущих причин госпитальной смертности и представляет собой тяжёлое системное заболевание, которое возникает в ответ на инфекцию и характеризуется нарушением регуляции иммунного ответа , что влечет за собой общее нарушение функций органов [1]. По данным глобального исследования, ежегодно в мире регистрируется свыше 48 миллионов случаев сепсиса, из которых около 11 миллионов заканчиваются летальным исходом [2]. Несмотря на то, что подход в лечении сепсиса остается консервативным, все больше внимания уделяется исследованиям молекулярно-клеточных механизмов, лежащих в основе патогенеза заболевания, на основе которых разрабатываются новые подходы к лечению заболевания. Такие механизмы, в частности, включают регуляцию иммунного ответа, метаболизм лактата и ряда других патогенных метаболитов [1].

Важную роль в возникновении и развитии сепсиса играют клетки врожденного иммунитета - нейтрофилы. Они первыми мигрируют к в зону воспаления, где осуществляют фагоцитоз, генерацию активных форм кислорода (АФК), а также формирование внеклеточных ловушек (NETs), что способствует уничтожению микроорганизмов [3, 4]. В процессе активации они усиливают как продукцию АФК, так и фагоцитарную активность, а также активно участвуют в локальной и системной регуляции воспаления. Однако избыточная и/или длительная активация нейтрофилов может приводить к повреждению тканей и развитию полиорганной недостаточности [4]

Особый интерес в изучении молекулярных механизмов развития сепсиса вызывает лактат, который является не только метаболическим маркером заболевания, но и активным регулятором иммунного ответа [5, 6]. При сепсисе концентрация лактата в периферической крови повышается, что может быть обусловлено тканевой гипоксией, а также митохондриальной дисфункцией, что приводит к активации анаэробного гликолиза как основного пути энергообеспечения. Однако, лактат может непосредственно влиять на функции иммунных клеток, в частности нейтрофилов. В связи с тем, что он одновременно является и метаболитом, и эпигенетическим фактором, лактат способен регулировать внутриклеточное и внеклеточное рН, подавлять или усиливать продукцию АФК, а также влиять на фагоцитарную активность [7].

Таким образом, исследование влияния лактата на функциональную активность нейтрофилов позволит лучше понять взаимосвязь между патологическими регуляторными процессами и состоянием врожденного иммунитета. В контексте изучения сепсиса это особенно актуально, так как нарушение иммунной регуляции приводит к неблагоприятным исходам течения заболевания.

В связи с этим, целью данного исследования является изучение влияния лактата in vitro на фагоцитоз и продукцию АФК нейтрофилами у септических пациентов.

 

Методы

На базе Красноярской межрайонной клинической больницы скорой медицинской помощи имени Н.С. Карповича были обследованы больные с подтвержденным диагнозом сепсиса (n = 30, средний возраст пациентов 54 года). Исходную степень тяжести больных определяли по шкале SAPSII. Наличие и степень выраженности полиорганной недостаточности определяли по шкале SOFA [8]. При оценке тяжести синдрома системной воспалительной реакции придерживались критериев ACCP/SCCM [9]. Забор крови для проведения исследования осуществляли в 1-ые сутки госпитализации. В качестве контрольной группы (n = 21) были обследованы практически здоровые добровольцы сопоставимого возрастного диапазона.

Выделение нейтрофильных гранулоцитов проводилось из цельной гепаринизированной крови путем центрифугирования с использованием двойного градиента плотности фиколл-урографина: ρ = 1,077 г/см³ –для отделения лимфоцитов, ρ = 1,119 г/см³ – для получения фракции нейтрофилов. Полученные в процессе клетки разводили в растворе Хэнкса (ПанЭко, Россия) и разделяли на две пробы: контрольную и с добавлением лактата (1 мМ L-Lactic acid sodium salt, Sigma-Aldrich, USA). После инкубации клеток в течение 1 часа при температуре 37^оС в CO₂-инкубаторе (Sanyo, Япония) изучали фагоцитарную и хемилюминесцентную активность нейтрофилов.

Оценку фагоцитарной активности нейтрофилов проводили с использованием метода проточной цитометрии с применением моноклональных антител CD16 и CD62L. В качестве объекта фагоцитоза использовали FITC-меченный стафилококковый белок А. Количественная оценка степени фагоцитоза проводилась путем измерения интенсивности флуоресценции с использование проточного цитофлуориметра FC-500 (Beckman Coulter, USA) [10].

В каждой пробе анализировали не менее 50000 нейтрофилов. Подсчитывали процент флуоресцирующих нейтрофилов (определяли как фагоцитарный индекс – ФИ) и средний уровень флуоресценции клеток (фагоцитарное число – ФЧ).

Для оценки способности нейтрофилов продуцировать АФК применяли метод хемилюминесценции (ХЛ) с двумя детектирующими агентами – люминол и люцигенин (Sigma, США, концентрация 10^-5 М) [11].

Регистрацию кинетики и уровня синтеза АФК проводили на 36-канальном хемилюминометре «CL3607» (ООО «МедБиоТех», Красноярск, Россия) в течении 90 минут. По результатам анализа кривой ХЛ рассчитывали: Imax – пиковую интенсивность свечения, Тmax – время выхода на максимум, S – площадь под кривой, которая отражает общее количество синтезированных АФК. Для оценки интенсивности хемилюминесценции, индуцированной зимозаном, рассчитывали индекс активации (ИА) как отношение площади индуцированной ХЛ к площади спонтанной ХЛ.

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программного пакета Statistica 12.0 (StatSoft Inc., USA, 2013). Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильного размаха в виде 1 и 3 квартилей (Q₁ и Q₃). Достоверность различий между показателями независимых выборок (сравнение с показателями контрольной группы) оценивали по непараметрическому U-критерию Манна-Уитни. Достоверность различий между контрольными пробами и с лактатом определяли по критерию Вилкоксона (Wilcoxon matched pairs test). Для исследования силы взаимосвязей показателей вычислялся коэффициент ранговой корреляции по Спирмену (r).

Результаты

При исследовании фагоцитарной активности в контрольных условиях (без добавления лактата), было обнаружено, что фагоцитарный индекс (ФИ) нейтрофилов не показал достоверных различий между группами здоровых доноров и пациентов с сепсисом (рис. 1a). Однако средний уровень флуоресценции фагоцитирующих клеток (ФЧ) был статистически значимо выше у пациентов с сепсисом (рис. 1b).

Инкубация зрелых нейтрофилов с лактатом у лиц контрольной группы не приводила к изменению величины ФИ, тогда как у пациентов с сепсисом отмечалось его умеренное, но статистически значимое увеличение относительно исходных значений (рис. 1c). При этом ФЧ в группе сепсиса сохраняло значительное повышение по сравнению с контролем (рис. 1d).

Сходная закономерность была выявлена и для незрелых гранулоцитов. Независимо от воздействия лактата, значения ФИ не различались между пациентами с сепсисом и контрольной группой (рис. 2a, 2c). В то же время ФЧ у пациентов с сепсисом было достоверно выше, чем у здоровых доноров, как в контрольных условиях, так и после инкубации с лактатом (рис. 2b, 2d).

При исследовании особенностей хемилюминесцентной активности нейтрофильных гранулоцитов было установлено, что у пациентов с сепсисом при спонтанной люцигенин-зависимой хемилюминесценции время выхода на максимум значительно увеличивается по сравнению с контролем (рис. 3a). При этом максимум интенсивности и площадь под кривой достоверно снижаются, указывая на угнетение функции нейтрофилов (рис. 3b, 3c). Инкубация с лактатом также показала достоверное увеличение времени выхода на максимум у больных сепсисом (рис. 3d), но при сниженной интенсивности и площади под кривой (рис. 3e, 3f).

Индуцированная люцигенин-зависимая хемилюминесценция у пациентов с сепсисом характеризуется также увеличенным временем выхода на максимум, как в контрольных пробах, так и с лактатом (рис. 4a, 4d). Максимум интенсивности и площадь под кривой при сравнении обеих групп не подтверждаются статистической значимостью (рис. 4b, 4c, 4e, 4f).

Исследование спонтанной люминол-зависимой хемилюминесценции также демонстрирует достоверное увеличение времени выхода на максимум у пациентов с сепсисом по сравнению со здоровыми донорами (рис. 5a). Однако, максимум интенсивности и площадь под кривой, без добавления лактата, выше у контрольной группы (рис. 5b, 5c). После воздействия лактата различия по данным параметрам сохраняются и усиливаются (рис. 5d, 5e, 5f).

Индуцированная люминол-зависимая хемилюминесценция также сопровождается увеличением времени выхода на максимум у септических пациентов как при контрольных условиях, так и при инкубации с лактатом (рис. 6a, 6d). Максимум интенсивности и площадь под кривой у пациентов с сепсисом ниже, чем у контрольной группы, при этом статистически значимые различия подтверждены только в контроле без лактата (рис. 5b, 5c, 5e, 5f).

Обсуждение

В ряде ранее проведенных исследованиях показано, что функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов при сепсисе меняется [12, 13]. В нашем исследовании также обнаружено изменение функциональных механизмов нейтрофилов у обследованных больных сепсисом, которое проявляется в подавлении синтеза АФК при сохранении фагоцитарной активности зрелых нейтрофилов.

Современные исследования подтверждают, что фагоцитоз незрелых форм нейтрофилов всегда остается неполноценным по сравнению со зрелыми – они демонстрируют пониженную опсонизацию, снижение выработки АФК и как следствие менее эффективное уничтожение патогенов. Особенно важно это учитывать в контексте сепсиса, когда на фоне экстренного гранулопоэза в кровоток поступает большое количество незрелых нейтрофилов, которые не могут в полной мере компенсировать функции зрелых нейтрофилов [14].

Отсутствие изменений фагоцитарного индекса зрелых нейтрофилов при повышении среднего уровня флуоресценции у пациентов с сепсисом может свидетельствовать о том, что общее количество фагоцитирующих клеток сохраняется, однако их функциональная активность усиливается, что объясняется компенсаторным механизмом, который запускается при воспалении. При этом обнаружено, что при добавлении лактата ФИ как у пациентов с сепсисом, так и у здоровых доноров увеличился по отношению к контрольным условиям, что подчеркивает регуляторное действие лактата [7]. Исследование фагоцитарной активности незрелых гранулоцитов, также показало повышенный ФЧ у септических пациентов, что указывает на иммобилизацию молодых клеток из костного мозга для поддержания фагоцитарной активности в условиях воспаления. Эти клетки наравне со зрелыми нейтрофилами способны активно включаться в процесс фагоцитоза, но при этом имеют ограниченную способность продуцировать АФК [15]. Несмотря на полученные результаты, которые демонстрируют, что при сепсисе нейтрофильные гранулоциты сохраняют способность к фагоцитозу, они также демонстрируют выраженные признаки нарушения функций окислительного метаболизма. При анализе хемилюминесцентной активности было обнаружено, что у пациентов с сепсисом как люцигенин –, так и люминол-зависимая ХЛ сопровождается увеличением Tmax при снижении Imax и S, особенно, в спонтанных реакциях. Это указывает на снижение активности НАДФН-оксидазы и ослабление как внутриклеточного, так и внеклеточного киллинга [11]. Добавление лактата оказывало разнонаправленное действие на функциональную активность нейтрофилов. У здоровых доноров инкубация с лактатом приводила к умеренному повышению фагоцитарной активности, при этом исходные характеристики продукции АФК сохранялись. У пациентов с сепсисом лактат также повышал активность фагоцитоза, однако генерация АФК была угнетена по сравнению с контрольными значениями, а в ряде случаев, наблюдалось дополнительное замедление реакции. Таким образом, в группе пациентов с сепсисом, наблюдается функциональный дисбаланс между поглощением и респираторным взрывом. Вероятной причиной является высокая доля незрелых гранулоцитов, способных активно фагоцитировать, но ограниченно продуцирующих АФК из-за незрелости ферментных систем, что приводит к незавершенному фагоцитозу.

Заключение

У пациентов с сепсисом нейтрофилы сохраняют фагоцитарную способность (независимо от степени зрелости), однако их окислительный метаболизм существенно нарушен, что проявляется замедлением развития респираторного взрыва и снижением генерации активных форм кислорода.

При добавлении лактата in vitro отмечалось умеренное усиление фагоцитарной активности как у пациентов с сепсисом, так и у здоровых доноров. При этом продукция АФК в группе сепсиса оставалась существенно сниженной, что отражает дисбаланс между поглощением и киллингом. Полученные данные демонстрируют, что стимуляция фагоцитоза не компенсирует нарушение респираторного взрыва, а лактат может выступать как потенциальный модулятор клеточного ответа, способный избирательно влиять на отдельные функциональные механизмы нейтрофилов, провоцируя развитие незавершенного фагоцитоза и стимулируя активность воспаления.

 

 

Дополнительная информация

Вклад авторов

• Савченко Е.В. — определение концепции, проведение экспериментов, сбор и обработка данных, подготовка визуализации, написание первоначального варианта рукописи.;
• Борисов Р.Н. — редактирование текста рукописи, визуализация;
• Борисов С.А. — редактирование текста рукописи, визуализация.

Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируют надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности*

Этическая экспертиза

Исследование одобрено локальным этическим комитетом Федерального исследовательского центра «Красноярский научный центр» СО РАН. Протокол № 10 от 28.10.2024. От участников получено письменное информированное согласие на использование биологического материала и данных в научных целях.

Согласие на публикацию

 «неприменимо».

Источники финансирования

Работа выполнена в рамках государственного задания № FWES-2024-0016

Рег. номер 225020106474-5

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ С ДРУГИМИ СИСТЕМАМИ ОРГАНИЗМА У ЖИТЕЛЕЙ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ

Раскрытие интересов

Автор заявляет об отсутствии финансовых и нефинансовых интересов, связанных с содержанием данной статьи.

Заявление об оригинальности

Все материалы (данные, текст, иллюстрации) использованы впервые и не публиковались ранее.

Доступ к данным

Все данные представлены в статье и/или приложениях к ней.

Генеративный искусственный интеллект

Не использовался.

Рассмотрение и рецензирование

Рукопись направлена в редакцию инициативно.

Дисклеймер*

Рисунки

Рисунок 1. Показатели фагоцитоза зрелых нейтрофилов у здоровых доноров и пациентов с сепсисом: (a – b) –контрольные условия; (c – d) – инкубация с лактатом. Показатели: a – фагоцитарный индекс – (ФИ), b – средний уровень флуоресценции клеток (фагоцитарное число – ФЧ), c – фагоцитарный индекс – (ФИ) с нагрузкой лактатом, d – средний уровень флуоресценции клеток (фагоцитарное число – ФЧ) с нагрузкой лактатом. 1 — контрольная группа (здоровые доноры), 2 – пациенты с сепсисом.

Рисунок 2. Показатели фагоцитоза незрелых гранулоцитов у здоровых доноров и пациентов с сепсисом: (a – b) –контрольные условия; (c – d) – инкубация с лактатом. Показатели: a – фагоцитарный индекс – (ФИ), b – средний уровень флуоресценции клеток (фагоцитарное число – ФЧ), c – фагоцитарный индекс – (ФИ) с нагрузкой лактатом, d – средний уровень флуоресценции клеток (фагоцитарное число – ФЧ) с нагрузкой лактатом. 1 — контрольная группа (здоровые доноры), 2 – пациенты с сепсисом.

Рисунок 3. Спонтанная люцигенин-зависимая хемилюминесценция нейтрофилов у здоровых и пациентов с сепсисом: (a – c) — контрольные условия; (d – f) — инкубация с лактатом. Показатели: a — время выхода на максимум спонтанной ХЛ, b — максимум интенсивности спонтанной ХЛ, c — площадь под кривой спонтанной ХЛ, d — время выхода на максимум спонтанной ХЛ с нагрузкой лактатом, e — максимум интенсивности спонтанной ХЛ с нагрузкой лактатом, f — площадь под кривой спонтанной ХЛ с нагрузкой лактатом. 1 — контрольная группа (здоровые доноры), 2 – пациенты с сепсисом.

Рисунок 4. Индуцированная люцигенин-зависимая хемилюминесценция нейтрофилов у здоровых и пациентов с сепсисом: (a – c) — контрольные условия; (d – f) — инкубация с лактатом. Показатели: a — время выхода на максимум индуцированной ХЛ, b — максимум интенсивности индуцированной ХЛ, c — площадь под кривой спонтанной ХЛ, d — время выхода на максимум индуцированной ХЛ с нагрузкой лактатом, e — максимум интенсивности индуцированной ХЛ с нагрузкой лактатом, f — площадь под кривой индуцированной ХЛ с нагрузкой лактатом. 1 — контрольная группа (здоровые доноры), 2 – пациенты с сепсисом.

Рисунок 5. Спонтанная люминол-зависимая хемилюминесценция нейтрофилов у здоровых и пациентов с сепсисом: (a – c) — контрольные условия; (d – f) — инкубация с лактатом. Показатели: a — время выхода на максимум спонтанной ХЛ, b — максимум интенсивности спонтанной ХЛ, c — площадь под кривой спонтанной ХЛ, d — время выхода на максимум спонтанной ХЛ с нагрузкой лактатом, e — максимум интенсивности спонтанной ХЛ с нагрузкой лактатом, f — площадь под кривой спонтанной ХЛ с нагрузкой лактатом. 1 — контрольная группа (здоровые доноры), 2 – пациенты с сепсисом.

Рисунок 6. Индуцированная люминол-зависимая хемилюминесценция нейтрофилов у здоровых и пациентов с сепсисом: (a – c) — контрольные условия; (d – f) — инкубация с лактатом. Показатели: a — время выхода на максимум индуцированной ХЛ, b — максимум интенсивности индуцированной ХЛ, c — площадь под кривой индуцированной ХЛ, d — время выхода на максимум индуцированной ХЛ с нагрузкой лактатом, e — максимум интенсивности индуцированной ХЛ с нагрузкой лактатом, f — площадь под кривой индуцированной ХЛ с нагрузкой лактатом. 1 — контрольная группа (здоровые доноры), 2 – пациенты с сепсисом.

About the authors

Ekaterina V Savchenko

Laboratory of the Cellular Molecular Physiology and Pathology of the Federal Research Center «Krasnoyarsk Science Center» of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Scientific Research Institute of medical problems of the North

Author for correspondence.
Email: sav-eka-00@mail.ru
ORCID iD: 0009-0005-2114-581X
SPIN-code: 7235-5987
Scopus Author ID: 62024
ResearcherId: MIK-4716-2025
Russian Federation, Krasnoyarsk, Russia (660022, Krasnoyarsk, P. Geleznyaka street, 3G)

Roman N Borisov

Email: boron-5@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9670-9476
SPIN-code: 4606-7206

PhD in Medical Sciences, Associate Professor, Associate Professor of the Department

Russian Federation, FSBEI of Higher Education «Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Krasnoyarsk, Russia (660022, Krasnoyarsk, P. Geleznyaka street, 1A)

Sergey A Borisov

Laboratory of the Cellular Molecular Physiology and Pathology of the Federal Research Center «Krasnoyarsk Science Center» of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Scientific Research Institute of medical problems of the North, Krasnoyarsk, Russia (660022, Krasnoyarsk, P. Geleznyaka street, 3G)

Email: borisov1207@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0449-5333
Russian Federation

References

Supplementary files