Investigation of the mechanism of action of sodium aminodihydrophthalazinedione on the metabolism of neutrophil granulocytes in vitro



Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

Foundation. Currently, the number of diseases associated with impaired immune system function is increasing worldwide which requires the development of new immunotherapy methods. A promising direction is to determine the mechanism of action of the Tameron on phagocytic cells of the immune system (the main therapeutic effect of the medicine) implemented at the cellular and subcellular level (organizational level of the target) using bioluminescent analysis.

Purpose. Study the mechanisms of Tameron's effect on the metabolism of neutrophilic granulocytes in vitro in healthy people.

Materials and methods. 34 healthy women aged 23-33 years were examined. Bioluminescent determination of the activity of NAD- and NADP-dependent dehydrogenases in neutrophilic granulocytes according to the method we developed was carried out using a biochemiluminescent analyzer BLM-3607 (LLC MedBioTech, Krasnoyarsk). The study of neutrophil granulocyte survival was conducted in the dynamics of control incubation (without Tameron) and with Tameron.

Results. The results of bioluminescent analysis of the activity levels of NAD- and NADP-dependent dehydrogenases in healthy women after 3 hours of control incubation (without Tamerone) indicate a decrease in the intensity of the substrate flow along the main metabolic pathways and cycles that determine the levels of anaerobic and aerobic energy of cells and their plastic processes which leads to a decrease in the functional activity of neutrophilic granulocytes. A decrease in the key reaction of lipid anabolism, the reactivity of the glutathione-dependent antioxidant system and the anaerobic and aerobic reactions of LDH is detected from the cytoplasmic compartment of neutrophilic granulocytes, as well as a decrease in the level of substrate flow through the tricarboxylic acid cycle and inhibition of the key reaction of the malate-aspartate shunt in the mitochondrial compartment. Similar significant changes in the activity of NAD(P)-dependent dehydrogenases of neutrophil granulocytes are detected only after 24 hours of incubation with Tameron.

Conclusion. Tameron in vitro promotes the survival of neutrophil granulocytes by slowing down the depletion of cellular resources, delaying the decline in metabolic activity and biocidal reactivity.

Key words: immunotherapy; functional activity of neutrophils; NAD-dependent dehydrogenases; NADP-dependent dehydrogenases; bioluminescent analysis.

Full Text

Обоснование

 В настоящее время во всем мире растет число заболеваний, связанных с нарушениями функций иммунной системы. По прогнозу Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в XXI веке заболевания, связанные с нарушениями иммунной системы, выходят на первое место, опережая сердечно-сосудистую патологию [1, 2]. В связи с этим, разработка новых методов иммунотерапии становятся важной медико-биологической проблемой.

Одним из наиболее перспективных препаратов является «Тамерон». Тамерон представляет собой 5-амино-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-1,4-диона натриевую соль [3-6]. Эффективность противовоспалительной терапии обусловлена способностью препарата уменьшать синтез TNF-фактора, ИЛ-1, других цитокинов и острофазных белков гиперактивированных макрофагов. Эффект достигается путем стабилизации внутриклеточного фактора Nrf2, который активирует гены, кодирующие синтез белков нескольких групп защиты с ингибированием фагоцитирующими клетками синтеза РНК, ДНК и цитокинов (на 6-8 часов), при усилении микробоцидной системы, что  предотвращает развитие выраженного воспалительного процесса [7]. Препарат подавляет избыточную активность макрофагов в легкой обратимой форме, оказывая ингибирующий эффект только на время применения. Тамерон усиливает фагоцитоз и повышает неспецифическую резистентность организма к инфекционным заболеваниям, оказывает протективное действие на проявление токсемии, способствует противомикробной защите. Выраженное противовоспалительное действие препарата весьма выгодно отличает его, с одной стороны, от стимуляторов иммунного ответа с частыми провоспалительными осложнениями и, с другой – от нестероидных противовоспалительных препаратов и кортикостероидов с их многочисленными побочными эффектами [8, 9].

Однако полностью механизм действия препарата до сих пор не изучен. Перспективным направлением является определение механизма действия тамерона на фагоцитирующие клетки иммунной системы (основное терапевтическое действие препарата), причем реализованное на клеточном и субклеточном уровне (организационный уровень мишени). Ответ клетки зависит от интенсивности поступающих сигналов, которая определяется не только количеством циркулирующих в крови регуляторных веществ, но и чувствительностью к ним клеток. В то же время метаболизм клетки является основой любого проявления ее жизнедеятельности в связи, с чем метаболические параметры не могут не отражать ее функциональные возможности [10-17]. Из современных методов, наиболее подходящих для исследования внутриклеточного метаболизма, являются методы биолюминесцентного анализа, экспресность и точность которых позволяет применять их в клинической лабораторной диагностике.

 Цель

Изучение механизмов влияния препарата «Тамерон» на метаболизм нейтрофильных гранулоцитов in vitro у здоровых людей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводилось на базе клинического подразделения лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии НИИ медицинских проблем Севера ФИЦ КНЦ СО РАН. Обследовано 34 женщины в возрасте 23-33 лет. Всем пациенткам перед лечением проводилось общеклиническое и гинекологическое обследование (анализ жалоб, сбор гинекологического анамнеза, осмотр шейки матки в зеркалах, бимануальное исследование, бактериоскопическое исследование вагинального отделяемого, диагностические тесты на наличие сопутствующих инфекций, передаваемых половым путем). Также проводилось специальное обследование: простая и расширенная кольпоскопии, цитологическое исследование мазков отпечатков с шейки матки и соскобов из цервикального канала, цитологическое исследование прицельно взятого биоптата шейки матки, типирование вируса папилломы человека методом ПЦР. У всех обследованных осуществлялся забор крови для определения уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в нейтрофильных гранулоцитах.

Биолюминесцентный анализ уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ нейтрофильных гранулоцитов. Нами разработаны биолюминесцентные методы определения активности следующих НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49), глицерол-3-фосфатдегидрогеназа (Г3ФДГ, КФ 1.1.1.8), малик-фермент (НАДФМДГ, КФ 1.1.1.40), НАД- и НАДН-зависимые реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДН-ЛДГ, КФ 1.1.1.27), НАД- и НАДН-зависимые реакции малатдегидрогеназы (МДГ и НАДН-МДГ, КФ 1.1.1.37), НАДФ- и НАДФН-зависимая глутаматдегидрогеназа (НАДФГДГ и НАДФН-ГДГ, КФ 1.4.1.4), НАД- и НАДН-зависимая глутаматдегидрогеназа (НАДГДГ и НАДН-ГДГ, КФ 1.4.1.2), НАД- и НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа (НАДИЦДГ, КФ 1.1.1.41 и НАДФИЦДГ, КФ 1.1.1.42, соответственно) и глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2) [18]. Биолюминесцентное определение активности прямых (НАД- и НАДФ-зависимых) реакций указанных дегидрогеназ проводили следующим образом: 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов (лимфоциты разрушали путем осмотического лизиса с добавлением дитиотреитола (ДТТ) 1,5×10-3М) вносили в 600 в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат в концентрации 10-5-10-2 М и кофермент в концентрации 10-6-10-2 М при рН 70-10,0 (в 0,1 М К+,Na+-фосфатном или трис-HCl-буфере). После инкубации при 370С в течение 30 минут к 200 мкл инкубационной смеси добавляли биолюминесцентные реактивы: 50 мкл миристинового альдегида в концентрации 0,0005 %, 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) – 1,5×10-5 М и 50 мкл биферментного комплекса – НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза. Все реактивы биолюминесцентной системы разведены в 0,1 М К+-, Na+-фосфатном буфере с рН 7,0. После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биохемилюминесцентного анализатора БЛМ-3607 (ООО “МедБиоТех”, г. Красноярск) производили измерение свечения.

Статистические методы исследования. По результатам исследования в пакете электронных таблиц MS Excel 2019 была сформирована база данных, на основе которой, с помощью пакета прикладных программ Statistica 10, производился статистический анализ. Выборку описывали с помощью подсчета медианы (Me) и интерквартильного размаха в виде 25 и 75 процентилей (С25 и С75). Значимость различий между показателями контрольной группы и группы больных оценивали по непараметрическому критерию Mann-Whitney. Значимость различий в динамике инкубации клеток с препаратом «Тамерон» определяли по критерию Wilcoxon. Статистически значимыми считали значения р<0,05.

 РЕЗУЛЬТАТЫ

При исследовании выживаемости нейтрофильных гранулоцитов в динамике контрольной инкубации (без тамерона) обнаружено, что уровень выживаемости клеток через 1 час в среднем составил 98,2 %, через 3 часа – 85,1%, через 24 часа – менее 50 %. Данная динамика выживаемости нейтрофильных гранулоцитов в культуре определяется несколькими факторами. Во-первых, нейтрофильные гранулоциты являются относительно короткоживущими клетками. Во-вторых, в процессе своей жизнедеятельности данный тип клеток продуцирует различные токсичные вещества (в том числе, и активные формы кислорода и азота), которые также воздействуют и на мембрану самих нейтрофильных гранулоцитов. В связи с этим, мы максимально уменьшили количество клеток в инкубационной пробе – до 2 млн/мл (для дальнейшего проведения биолюминесцентного анализа). По причине низкого уровня выживаемости нейтрофильных гранулоцитов у женщин контрольной группы через 24 часа инкубации мы не проводили биолюминесцентный анализ.

При исследовании уровней активности НАД-зависимых дегидрогеназ в нейтрофильных гранулоцитах здоровых женщин в динамике контрольной инкубации обнаружено, что статистически достоверные изменения обнаруживаются на 3 часу инкубации (табл. 1). Так, через 3 часа инкубации в клетках снижается активность ЛДГ, МДГ, НАДИЦДГ, НАДН-ЛДГ и НАДН-МДГ. Причем статистическая значимость изменений активности указанных ферментов определяется не только относительно контрольного уровня (контроль), но и активности ферментов, выявленных через 1 час инкубации.

При исследовании уровней активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ нейтрофильных гранулоцитов у здоровых женщин в динамике контрольной инкубации обнаружены аналогичные вышеуказанным изменения: статистически достоверное снижение активности Г6ФДГ, НАДФМДГ и ГР выявлены через 3 часа инкубации (табл. 2). Также статистическая достоверность определяется как относительно контрольного уровня, так и выявленного через 1 час инкубации.

Таким образом, результаты биолюминесцентного анализа уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ указывают на снижение интенсивности субстратного потока по основным метаболическим путям и циклам, определяющим уровни анаэробной и аэробной энергетики клеток и их пластических процессов, что приводит к снижению функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов.

При исследовании выживаемости нейтрофильных гранулоцитов в динамике инкубации с препаратом «Тамерон» обнаружено значительное повышение относительно уровня, выявляемого при контрольной инкубации. Через 1 час инкубации он составляет 98,9 %, через 3 часа – 96,7% и через 24 часа – 93,6 %. В связи с этим, мы исследовали метаболическую активность нейтрофильных гранулоцитов в динамике инкубации с тамероном у здоровых женщин на всем протяжении инкубационного периода.

При исследовании уровней активности НАД-зависимых дегидрогеназ нейтрофильных гранулоцитов у здоровых женщин обнаружено, что статистически выраженные изменения выявляются через 24 часа инкубации с тамероном (табл. 3). Эти изменения определяются значительным снижением активности ЛДГ, МДГ, НАДИЦДГ и НАДН-ЛДГ относительно исходного уровня (контроль) и выявленного через 1 и 3 часа инкубации. Активность НАДН-МДГ в нейтрофильных гранулоцитах статистически достоверно снижается при инкубации с тамероном через 24 часа относительно исходного уровня и выявленного через 1 час инкубации.

При исследовании уровней активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ нейтрофильных гранулоцитов у здоровых женщин также обнаружено, что статистически выраженные изменения выявляются через 24 часа инкубации с тамероном (табл. 4). На этом периоде инкубации статистически достоверно снижается активность МДГ и ГР как относительно исходного уровня, так и уровней, выявленных через 1 и 3 часа инкубации.

Анализ результатов биолюминесцентного анализа позволяет отметить следующее. Обнаруженные через 24 часа инкубации с тамероном изменения в уровнях активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ нейтрофильных гранулоцитов у здоровых женщин при инкубации с тамероном соответствуют выявленным через 3 часа при контрольной инкубации. Со стороны цитоплазматического компартмента нейтрофильных гранулоцитов выявляется снижение ключевой реакции липидного анаболизма (НАДФМДГ), реактивности глутатион-зависимой антиоксидантной системы (за счет ингибирования ГР) и анаэробной и аэробной реакций ЛДГ, что позволяет заключить о понижении интенсивности терминальных реакции анаэробного гликолиза и понижении наработки пирувата, который может использоваться в метаболической системе митохондриального компартмента для поддержки аэробного дыхания клеток [19]. Соответственно, состояние митохондриального компартмента нейтрофильных гранулоцитов характеризуется снижением уровня субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот (низкая активность НАДИЦДГ и МДГ) и ингибированием ключевой реакции малат-аспартатного шунта (НАДН-МДГ).

 

Обсуждение

Можно предположить, что метаболический механизм поддержки выживаемости нейтрофильных гранулоцитов в культуре поддерживается тамероном за счет стимуляции метаболических процессов цитоплазматического компартмента клеток (уровень активности ферментов через 3 часа инкубации соответствует исходному), следствием которой и является сохранение активности ферментов и митохондриального компартмента. При этом более длительная инкубация нейтрофильных гранулоцитов также вызывает истощение клеточных ресурсов, наблюдается снижение активности ферментов основных метаболических процессов и понижение уровня выживаемости клеток.

 Заключение

Таким образом, инкубация нейтрофильных гранулоцитов здоровых женщин без препарата «Тамерон» вызывает значительное истощение клеточных ресурсов уже через 3 часа, снижение интенсивности основных метаболических реакций, определяющих состояние клеточной энергетики и пластических процессов, понижение биоцидной реактивности и, соответственно, снижении выживаемости клеток. При инкубации с препаратом “Тамерон” истощение клеточных ресурсов нейтрофильных гранулоцитов наблюдается через 24 часа инкубации, при этом отсутствуют изменения биоцидной активности клеток и не выражено снижается выживаемость клеток.

×

About the authors

Andrei A. Savchenko

Federal Research Center «Krasnoyarsk Science Center» of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Scientific Research Institute of medical problems of the North

Email: aasavchenko@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5829-672X
SPIN-code: 3132-8260
Scopus Author ID: 56408

doctor of medicine, professor, head of the cellular-molecular physiology and pathology laboratory 

Russian Federation, 660022, Russia, Krasnoyarsk region, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznjaka str., 3G. Scientific Research Institute of medical problems of the North.

Elena N. Anisimova

Federal Research Center «Krasnoyarsk Science Center» of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Scientific Research Institute of medical problems of the North

Author for correspondence.
Email: foi-543@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6120-159X
SPIN-code: 4610-7610

Ph.D., senior researcher at the laboratory

Russian Federation, 660022, Russia, Krasnoyarsk region, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznjaka str., 3G. Scientific Research Institute of medical problems of the North.

Elena А. Tsarkova

"Medical Clinic Aksiomed"

Email: servic@axiomed.ru
SPIN-code: 5202-6035

doctor

142200, Moscow region, Serpukhov, 2-ya Moskovskaya st., bldg. 6

Alexandr G. Borisov

Federal Research Center «Krasnoyarsk Science Center» of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Scientific Research Institute of medical problems of the North

Email: 2410454@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6930-3243
SPIN-code: 9570-2254

Institute of Medical Problems of the North, MD, Cand. Sci. (Medicine), Leading Research Associate of Laboratory of Cell and Mollecular Phisiology and Patology

Russian Federation, 660022, Russia, Krasnoyarsk region, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznjaka str., 3G. Scientific Research Institute of medical problems of the North.

References

  1. Kasparov E.V., Savchenko A.A., Kudlay D.A., Kudryavtsev I.V., Tikhonova E.P., Golovkin A.S., Borisov A.G. Clinical Immunology. Rehabilitation of the immune system. Krasnoyarsk: Ver-sona, 2022. 196 p. EDN: XMNDAQ
  2. Kozlov V.A., Tikhonova E.P., Savchenko A.A., Kudryavtsev I.V., Andronova N.V., Anisi-mova E.N., Golovkin A.S., Demina D.V., Zdzitovetsky D.E., Kalinina Yu.S., Kasparov E.V., Kozlov I.G., Korsunsky I.A., Kudlai D.A., Kuzmina T.Yu., Minoranskaya N.S., Prodeus A.P., Starikova E.A., Cherdantsev D.V., Chesnokov A.B., Shesternya P.A., Borisov A.G. Clinical immunology. A practical guide for infectious disease specialists. Krasnoyarsk: Polikor, 2021. 576 p.
  3. Ermakov A.M., Gorlo O.P., Krasnova Yu.V., Volsky V.S., Present M.A., Tsarkov A.N., Rud-nev D.S. On approaches to obtaining high-purity sodium salt of luminol (sodium 3-aminophthalhydrazide, sodium 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione) - the basis of the drug Tameron // Bulletin of the Institute of Engineering Physics. 2022. No. 1 (63). P. 104-105.
  4. Krasnova Yu.V., Chistyakova A.V. Standardization of the drug "Tameron®" using IR spec-trometry // Bulletin of the Institute of Engineering Physics. 2023. No. 1 (67). P. 89-91. EDN: UDSKMU
  5. Maevsky E.I., Bogdanova L.A., Kosyakova N.I. Possible pathogenetic justification for the treatment of post-COVID syndrome // Bulletin of the Institute of Engineering Physics. 2023. No. 2 (68). P. 107-112.
  6. Tsarkova E., Filippova K., Afanasyeva V., Ermakova O., Kolotova A., Blagodatski A., Er-makov A. A Study on the Planarian Model Confirms the Antioxidant Properties of Tameron against X-ray- and Menadione-Induced Oxidative Stress // Antioxidants (Basel).2023.Vol. 12, no. 4.P. 953.
  7. Jung KA, Kwak MK. The Nrf2 system as a potential target for the development of indirect antioxidants. Molecules. 2010 Oct 20;15(10):7266-91. doi: 10.3390/molecules15107266
  8. Ermakov AM, Tsarkova EA On the antioxidant activity of the drug "Tameron" // Bulletin of the Institute of Engineering Physics. 2020. No. 3 (57). P. 103-106.
  9. Tsarkov AN, Krasnova Yu.V., Tsarkova EA Technology of production of the immunotropic innovative drug "Tameron" // Bulletin of the Institute of Engineering Physics. 2020. No. 2 (56). P. 82-86.
  10. Kurtasova LM, Savchenko AA, Shkapova EA Clinical aspects of functional disorders of neutrophilic granulocytes in oncopathology. Novosibirsk: Nauka, 2009.184 p.
  11. Savchenko AA, Borisov AG. Fundamentals of Clinical Immunometabolomics. Novosibirsk: Nauka, 2012. 263 p.
  12. Savchenko A.A., Zdzitovetsky D.E., Borisov A.G., Luzan N.A. Chemiluminescent and en-zymatic activity of neutrophilic granulocytes in patients with widespread purulent peritonitis de-pending on the outcome of the disease // Bulletin of the Russian Academy of Medical Sciences. 2014. Vol. 69, No. 5-6. P. 23-28.
  13. Savchenko A.A., Kudryavtsev I.V., Borisov A.G. Methods of assessment and the role of res-piratory burst in the pathogenesis of infectious and inflammatory diseases // Infection and Immuni-ty. 2017. Vol. 7, No. 4. P. 327-340.
  14. Savchenko A.A., Rossiev D.A., Shakina N.A. Neural network classification of patients with viral hepatitis B by the value of immunological parameters of the blood and the activity of metabolic enzymes of lymphocytes // Bulletin of new medical technologies. 1998. Vol. 5, No. 2. Pp. 102-105.
  15. Savchenko A.A., Shakina N.A., Kurtasova L.M. Features of immunological parameters of the blood and metabolic parameters of lymphocytes in patients with hepatitis A and B // Journal of Infectious Pathology. 1997. Vol. 4, No. 4. Pp. 24-27.O'Neill L.A., Kishton R.J., Rathmell J. A guide to immunometabolism for immunologists // Nat. Rev. Immunol.‒2016.‒Vol. 16, no. 9.‒P. 553-565.
  16. Stathopoulou C., Nikoleri D., Bertsias G. Immunometabolism: an overview and therapeutic prospects in autoimmune diseases // Immunotherapy.2019.Vol. 11, no. 9.P. 813-829.
  17. Savchenko A.A. Determination of the activity of NAD(P)-dependent dehydrogenases in neutro-phil granulocytes by the bioluminescent method // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2015. Vol. 159, No. 5. P. 656-660.
  18. Savchenko A.A., Kudlai D.A., Kudryavtsev I.V., Kasparov E.V., Golovkin A.S., Prodeus A.P., Borisov A.G. Technologies for diagnostics and correction of immunometabolic disorders. Clinical immunology for practicing physicians. Krasnoyarsk: AS-KIT, 2023.454 p.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) Anisimova E.N., Savchenko A.A., Tsarkova E.А., Borisov A.G.