Study of aminodihydrophthalazinedione sodium mechanism of action on the metabolism of neutrophilic granulocytes in vitro

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Современные эпидемиологические данные свидетельствуют о росте распространённости иммунопатологических состояний. Согласно прогностическим оценкам Всемирной организации здравоохранения [1, 2], к середине XXI века заболевания, связанные с нарушениями иммунной системы, могут занять лидирующую позицию в структуре общей заболеваемости, превысив показатели сердечно-сосудистой патологии. Эта тенденция определяет необходимость разработки новых подходов к иммунотерапии, что представляет собой значимую медико-биологическую проблему.

Особый научный и практический интерес вызывает препарат аминодигидрофталазиндиона натрия (5-амино-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-1,4-диона натриевая соль, АДНФ, Тамерон®), обладающий уникальным механизмом противовоспалительного действия [3–6]. Экспериментальные данные свидетельствуют о его способности модулировать цитокиновый профиль (снижать синтез TNF-фактора, IL-1 и других провоспалительных медиаторов), активировать систему антиоксидантной защиты через стабилизацию фактора Nrf2, оказывать избирательное воздействие на фагоцитарную активность. В результате происходит временное ингибирование фагоцитирующими клетками процессов синтеза РНК, ДНК и цитокинов (6–8 ч), усиление микробоцидной системы фагоцитов, что предотвращает развитие интенсивного воспалительного процесса [7].

Важной особенностью АДФН является его обратимый механизм действия, обеспечивающий временную супрессию гиперактивированных макрофагов без индукции стойких нарушений их физиологических функций. Препарат проявляет комплексное иммунотропное действие, характеризующееся стимуляцией фагоцитарной активности, усилением неспецифической резистентности организма, выраженными цитопротективными свойствами (предотвращение развития токсемических реакций и потенцирование антимикробных защитных механизмов).

Особого внимания заслуживает выраженный противовоспалительный профиль АДФН, отличающийся от классических иммуностимуляторов, способных индуцировать провоспалительные осложнения, и нестероидных противовоспалительных средств и кортикостероидов, обладающих широким спектром нежелательных эффектов [8, 9].

Несмотря на клиническую эффективность препарата, остаются недостаточно изученными точные молекулярные механизмы его воздействия на фагоцитирующие клетки, реализуемые на клеточном и субклеточном уровнях организации и метаболические аспекты фармакологического действия. Исследование метаболических параметров приобретает особую значимость, поскольку именно метаболизм определяет функциональные возможности клеток и их чувствительность к регуляторным воздействиям [10–17].

В этом контексте методы биолюминесцентного анализа представляются наиболее перспективными благодаря высокой точности и воспроизводимости результатов, возможности оценки внутриклеточных процессов в реальном времени и применимости в клинической диагностической практике.

ЦЕЛЬ

Изучить механизмы влияния АДФН на метаболизм нейтрофильных гранулоцитов in vitro у здоровых людей.

МЕТОДЫ

Исследование проведено на базе клинического подразделения лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии НИИ медицинских проблем Севера ФИЦ КНЦ СО РАН в период с 06.04.2025 по 30.05.2025. Обследовано 34 женщины в возрасте 23–33 лет. Все пациентки прошли комплексное клинико-лабораторное обследование, включавшее стандартный гинекологический осмотр, скрининг на инфекции, передающиеся половым путём, цитологическое исследование (мазков-отпечатков с шейки матки, соскобов из цервикального канала и прицельно взятых биопсийных образцов), и были признаны здоровыми. У всех обследованных осуществляли забор крови для последующего определения ферментативной активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в нейтрофильных гранулоцитах.

Выделение нейтрофильных гранулоцитов осуществляли по общепринятой методике на двойном градиенте плотности фиколл-верографина: р=1,077 г/см³ — для отделения лимфоцитов, р=1,119 г/см³ — для выделения нейтрофилов. Для удаления остатков эритроцитов осадок ресуспендировали в буфере для лизиса эритроцитов (0,83% раствор NH₄Cl в Tris-HCl-буфере, pH 7,2–7,4). Для контроля морфологического состава лейкоцитарной взвеси определяли чистоту выхода нейтрофилов (не менее 97%). Количество живых клеток оценивали по стандартной методике с использованием трипанового синего в камере Фукса–Розенталя. Клетки инкубировали (без и с АДФН) в питательной среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия).

Методы исследования активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ нейтрофильных гранулоцитов

Для оценки метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов были разработаны и применены оригинальные биолюминесцентные методики определения активности следующих ферментов:

• глутатионредуктазы (ГР);
• глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ);
• глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ);
• малик-фермента (НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа, НАДФ-МДГ);
• лактатдегидрогеназы (ЛДГ) — НАД- и НАДН-зависимые реакции;
• МДГ — НАДН-зависимые формы;
• глутаматдегидрогеназы (ГДГ) — НАД- и НАДН-зависимые формы;
• изоцитратдегидрогеназы (ИЦДГ) — НАД- и НАДФ-зависимые формы;
• ГДГ — НАДФ- и НАДФН-зависимые формы.

Для проведения анализа клеточный лизат получали методом осмотического лизиса лимфоцитов в присутствии 1,5×10⁻³М дитиотреитола. Инкубационную смесь готовили из соответствующего субстрата в концентрации 10⁻⁵–10⁻² М и кофермента в концентрации 10⁻⁶–10⁻² М в 0,1 М К⁺,Na⁺-фосфатном или Tris-HCl-буфере (рН 7,0–10,0).

Реакционная смесь включала:

• 50 мкл 0,0005% раствора миристинового альдегида;
• 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10⁻⁵ М;
• 50 мкл биферментного комплекса НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза;
• 0,1 М К⁺,Na⁺-фосфатный буфер (рН 7,0).

Все компоненты реакционной смеси разводили в 0,1 М К⁺,Na⁺-фосфатном буфере (рН 7,0). К 150 мкл инкубационной смеси добавляли 50 мкл клеточного лизата. Инкубировали при 37 °С в течение 30 мин. Затем добавляли реакционную смесь, перемешивали и измеряли интенсивность свечения с помощью биохемилюминесцентного анализатора БЛМ-3607 (ООО «МедБиоТех», г. Красноярск).

Статистический анализ

В ходе исследования в MS Excel 2019 была создана база данных. Для анализа использовали программу Statistica 10. Описательная статистика включала медиану (Me) и интерквартильный размах (25–75-й процентили). Группы сравнивали с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Значимость различий в динамике инкубации клеток с АДФН проверяли по критерию Уилкоксона. Статистически значимыми считали значения р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При оценке жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов в контроле (без АДФН) обнаружено, что через 1 ч процент живых клеток в среднем составил 98,2%, через 3 ч — 85,1%, через 24 ч — менее 50%. Данная динамика определяется несколькими факторами. Во-первых, нейтрофильные гранулоциты являются относительно короткоживущими клетками. Во-вторых, в процессе своей жизнедеятельности данный тип клеток продуцирует различные токсичные вещества (в том числе активные формы кислорода и азота), которые также воздействуют и на мембрану самих нейтрофильных гранулоцитов. В связи с этим мы максимально уменьшили количество клеток в инкубационной пробе — до 2 млн/мл (для дальнейшего проведения биолюминесцентного анализа). Через 24 ч инкубации мы не проводили биолюминесцентный анализ в контрольной постановке (по причине низкого процента жизнеспособных нейтрофильных гранулоцитов).

При исследовании уровней активности НАД-зависимых дегидрогеназ в нейтрофильных гранулоцитах в контроле обнаружено, что статистически значимые изменения фиксируются на 3-м часу инкубации (табл. 1). Так, через 3 ч инкубации в клетках снижается активность ЛДГ, МДГ, НАД-ИЦДГ, НАДН-ЛДГ и НАДН-МДГ. Причём статистическая значимость изменений активности указанных ферментов определялась не только относительно контрольного уровня (контроль), но и активности ферментов, выявленных через 1 ч инкубации.

 

Таблица 1. Активность НАД-зависимых дегидрогеназ в нейтрофильных гранулоцитах у здоровых женщин в динамике контрольной инкубации (Ме, С25–С75)

Table 1. Activity of NAD-dependent dehydrogenases in neutrophil granulocytes of healthy women during control incubation (Me, C25–C75)

Показатели	Контроль		Через 1 ч		Через 3 ч		Через 24 ч
	1		2		3		4
	Ме	С25–С75	Ме	С25–С75	Ме	С25–С75	Ме	С25–С75
Г3ФДГ	0,33	0,01–2,64	0,36	0,01–2,89	0,41	0,01–3,05	—	—
ЛДГ	28,66	2,36–107,34	22,61	3,14–98,47	4,69	0,01–15,47	—	—
					р1, 2 <0,01
МДГ	23,98	8,45–63,83	18,99	7,63–62,44	11,47	3,45–41,08	—	—
					р1, 2 <0,05
НАД-ГДГ	1,71	0,01–29,41	2,16	0,01–28,26	1,99	0,01–27,62	—	—
НАД-ИЦДГ	5,25	0,09–38,64	6,12	1,01–37,99	2,78	0,01–7,51	—	—
					р1, 2 <0,05
НАДН-ЛДГ	8,70	0,01–47,91	7,99	0,01–48,34	4,32	0,01–17,42	—	—
					р1, 2 <0,05
НАДН-МДГ	132,48	70,47–202,89	124,12	69,75–200,69	56,48	24,04–98,25	—	—
					р1, 2 <0,05
НАДН-ГДГ	7,78	0,01–42,83	6,45	0,01–34,50	7,01	0,01–36,82	—	—

Примечание. Г3ФДГ — глицерол-3-фосфатдегидрогеназа; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; МДГ — малатдегидрогеназа; НАД-ГДГ — никотинамидадениндинуклеотид-зависимая глутаматдегидрогеназа; НАД-ИЦДГ — никотинамидадениндинуклеотид-зависимая изоцитратдегидрогеназа; НАДН-ЛДГ — восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотид-зависимой лактатдегидрогеназы; НАДН-МДГ — восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотид-зависимой малатдегидрогеназы; НАДН-ГДГ — восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотид-зависимой глутаматдегидрогеназы.

 

При исследовании уровней активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ нейтрофильных гранулоцитов в контроле обнаружены аналогичные вышеуказанным изменения: статистически значимое снижение активности Г6ФДГ, НАДФ-МДГ и ГР выявлены через 3 ч инкубации (табл. 2). Кроме того, статистическая значимость определяется как относительно контрольного уровня, так и уровня, выявленного через 1 ч инкубации.

 

Таблица 2. Активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ в нейтрофильных гранулоцитах у здоровых женщин в динамике контрольной инкубации (Ме, С25–С75)

Table 2. Activity of NADP-dependent dehydrogenases in neutrophil granulocytes of healthy women during control incubation (Me, C25–C75)

Показатели	Контроль		Через 1 ч		Через 3 ч		Через 24 ч
	1		2		3		4
	Ме	С25–С75	Ме	С25–С75	Ме	С25–С75	Ме	С25–С75
Г6ФДГ	3,70	0,47–17,38	3,89	0,52–18,44	1,45	0,01–12,33	—	—
					р1, 2 <0,05
НАДФ-МДГ	5,91	0,01–39,25	4,58	0,01–33,59	1,33	0,01–16,99	—	—
					р1, 2 <0,05
НАДФ-ГДГ	0,04	0,01–1,71	0,11	0,01–2,15	0,08	0,01–1,87	—	—
НАДФ-ИЦДГ	17,71	4,04–74,31	16,55	3,68–72,48	17,01	2,98–65,22	—	—
ГР	12,64	3,80–54,23	10,28	2,13–50,67	4,32	0,01–8,77	—	—
					р1, 2 <0,05
НАДФН-ГДГ	48,76	10,53–109,25	39,78	9,62–99,18	40,12	10,23–100,45	—	—

Примечание. Г3ФДГ — глицерол-3-фосфатдегидрогеназа; НАДФ-МДГ — никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимая малатдегидрогеназа; НАДФ-ГДГ — никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимая глутаматдегидрогеназа; НАДФ-ИЦДГ — никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимая изоцитратдегидрогеназа; ГР — глутатионредуктаза; НАДФН-ГДГ — восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимой глутаматдегидрогеназы.

 

Результаты биолюминесцентного исследования активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ показывают снижение интенсивности потока субстратов по основным метаболическим путям и циклам, которые регулируют уровни аэробной и анаэробной энергетики клеток, а также их пластические процессы. Это, в свою очередь, уменьшает функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов.

При исследовании жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов при инкубации с АДФН обнаружено значительное повышение процента живых клеток по сравнению с контролем. Через 1 ч инкубации он составил 98,9%, через 3 ч — 96,7% и через 24 ч — 93,6%. В связи с этим мы исследовали метаболическую активность нейтрофильных гранулоцитов при инкубации с АДФН на всём протяжении инкубационного периода (1, 3 и 24 ч).

В ходе изучения активности НАД-зависимых дегидрогеназ нейтрофильных гранулоцитов обнаружено, что статистически выраженные изменения выявляются только через 24 ч инкубации с АДФН (табл. 3). Эти изменения определяются значительным снижением активности ЛДГ, МДГ, НАД-ИЦДГ и НАДН-ЛДГ относительно исходного уровня (контроль) и выявленного через 1 и 3 ч инкубации. Активность НАДН-МДГ в нейтрофильных гранулоцитах при инкубации с АДФН статистически значимо снижается через 24 ч относительно исходного уровня и выявленного через 1 ч инкубации.

 

Таблица 3. Активность НАД-зависимых дегидрогеназ в нейтрофильных гранулоцитах у здоровых женщин в динамике инкубации с аминодигидрофталазиндионом натрия (Ме, С25–С75)

Table 3. Activity of NAD-dependent dehydrogenases in neutrophil granulocytes of healthy women during incubation with sodium aminodihydrophthalazinedione (Me, C25–C75)

Показатели	Контроль		Через 1 ч		Через 3 ч		Через 24 ч
	1		2		3		4
	Ме	С25–С75	Ме	С25–С75	Ме	С25–С75	Ме	С25–С75
Г3ФДГ	0,33	0,01–2,64	0,28	0,01–2,15	0,36	0,01–2,48	0,37	0,01–2,56
ЛДГ	28,66	2,36–107,34	26,78	1,99–98,56	34,45	2,47–100,62	8,79	0,01–25,00
							р1–3 <0,05
МДГ	23,98	8,45–63,83	20,69	7,26–62,57	21,45	8,21–67,42	7,21	0,01–25,38
							р1–3 <0,05
НАД-ГДГ	1,71	0,01–29,41	1,85	0,01–30,42	1,68	0,01–28,67	1,96	0,01–29,55
НАД-ИЦДГ	5,25	0,09–38,64	5,43	0,08–34,88	5,27	0,09–35,12	1,62	0,01–14,70
							р1–3 <0,05
НАДН-ЛДГ	8,70	0,01–47,91	9,48	0,04–46,62	10,12	0,05–38,79	1,34	0,01–12,64
							р1–3 <0,01
НАДН-МДГ	132,48	70,47–202,89	120,87	68,78–200,14	100,64	52,99–194,56	50,11	14,78–68,79
							р1, 2 <0,05
НАДН-ГДГ	7,78	0,01–42,83	7,15	0,01–38,13	6,96	0,01–39,76	7,42	0,01–40,49

Примечание. Г3ФДГ — глицерол-3-фосфатдегидрогеназа; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; МДГ — малатдегидрогеназа; НАД-ГДГ — никотинамидадениндинуклеотид-зависимая глутаматдегидрогеназа; НАД-ИЦДГ — никотинамидадениндинуклеотид-зависимая изоцитратдегидрогеназа; НАДН-ЛДГ — восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотид-зависимой лактатдегидрогеназы; НАДН-МДГ — восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотид-зависимой малатдегидрогеназы; НАДН-ГДГ — восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотид-зависимой глутаматдегидрогеназы.

 

Подобные результаты получены и при исследовании активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ нейтрофильных гранулоцитов. Установлено, что статистически выраженные изменения обнаруживаются через 24 ч инкубации с АДФН (табл. 4). На этом периоде инкубации статистически значимо снижается активность МДГ и ГР как относительно исходного уровня, так и уровней, выявленных через 1 и 3 ч инкубации.

 

Таблица 4. Активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ в нейтрофильных гранулоцитах у здоровых женщин в динамике инкубации с аминодигидрофталазиндионом натрия (Ме, С25–С75)

Table 4. Activity of NADP-dependent dehydrogenases in neutrophil granulocytes of healthy women during incubation with sodium aminodihydrophthalazinedione (Me, C25–C75)

Показатели	Контроль		Через 1 ч		Через 3 ч		Через 24 ч
	1		2		3		4
	Ме	С25–С75	Ме	С25–С75	Ме	С25–С75	Ме	С25–С75
Г6ФДГ	3,70	0,47–17,38	3,89	0,25–16,59	3,45	0,48–18,47	2,58	0,26–11,06
НАДФ-МДГ	5,91	0,01–39,25	5,25	0,01–37,48	6,12	0,04–40,66	1,81	0,01–10,23
							р1–3 <0,05
НАДФ-ГДГ	0,04	0,01–1,71	0,10	0,01–2,85	0,08	0,01–1,52	0,07	0,01–2,11
НАДФ-ИЦДГ	17,71	4,04–74,31	18,56	5,12–72,68	17,12	4,77–67,69	19,33	3,25–41,22
ГР	12,64	3,80–54,23	16,88	3,69–52,45	15,52	2,76–50,20	2,69	0,01–8,33
							р1–3 <0,05
НАДФН-ГДГ	48,76	10,53–109,25	48,25	9,37–100,54	40,36	10,04–98,80	47,26	11,01–97,65

Примечание. Г3ФДГ — глицерол-3-фосфатдегидрогеназа; НАДФ-МДГ — никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимая малатдегидрогеназа; НАДФ-ГДГ — никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимая глутаматдегидрогеназа; НАДФ-ИЦДГ — никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимая изоцитратдегидрогеназа; ГР — глутатионредуктаза; НАДФН-ГДГ — восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимой глутаматдегидрогеназы.

 

Анализ результатов биолюминесцентного анализа позволяет отметить следующее. Обнаруженные через 24 ч инкубации с АДФН изменения уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ нейтрофильных гранулоцитов у здоровых женщин соответствуют тем, что выявлялись через 3 ч при контрольной инкубации без препарата. В цитоплазматическом компартменте нейтрофильных гранулоцитов наблюдается снижение ключевой реакции липидного анаболизма (НАДФ-МДГ). Также падает активность глутатион-зависимой антиоксидантной защиты (из-за подавления ГР) и ферментов гликолиза — ЛДГ. Это указывает на снижение интенсивности анаэробного расщепления глюкозы и уменьшение образования пирувата, который используется в метаболической системе митохондриального компартмента для поддержки аэробного дыхания клеток [19]. Соответственно, состояние митохондриального компартмента нейтрофилов характеризуется снижением уровня потока субстратов по циклу трикарбоновых кислот (низкая активность НАД-ИЦДГ и МДГ) и ингибированием ключевой реакции малатаспартатного шунта (НАДН-МДГ).

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты дают основания предполагать, что сохранение жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов в культуре поддерживается АДФН. Данный механизм реализуется посредством активации метаболических путей в цитоплазматическом компартменте (уровень активности ферментов через 3 ч инкубации соответствует исходному). Указанная метаболическая стимуляция, в свою очередь, обеспечивает функциональную сохранность митохондриального аппарата клеток.

Однако пролонгированная инкубация приводит к истощению внутриклеточных ресурсов, что проявляется значительным снижением активности ферментов основных метаболических процессов и, как следствие, прогрессирующим снижением жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов.

Интересно, что выявленный нами эффект АДФН не является уникальным для нейтрофилов. Полученные данные согласуются с работами, демонстрирующими наличие выраженного регуляторного влияния АДФН на функционально-метаболическую активность макрофагов, в частности на его способность модулировать провоспалительный ответ и усиливать антиоксидантную защиту. Под действием АДФН у макрофагов отмечается изменение морфометрических параметров, усиление метаболической активности и ускорение процессов созревания [20]. Таким образом, можно предположить, что АДФН выступает универсальным модулятором метаболизма клеток, механизм действия которого, по-видимому, направлен на поддержание их функциональной активности и жизнеспособности в условиях культивирования. Однако, как и в случае с макрофагами, эффект АДФН зависит от времени инкубации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, инкубация нейтрофильных гранулоцитов здоровых женщин без препарата АДФН (Тамерон®) уже через 3 ч вызывает значительное истощение клеточных ресурсов, снижение интенсивности основных метаболических реакций, определяющих состояние клеточной энергетики и пластических процессов, понижение биоцидной реактивности и, соответственно, снижение жизнеспособности клеток. При инкубации нейтрофильных гранулоцитов с препаратом АДФН признаки истощения клеточных ресурсов наблюдаются только через 24 ч, при этом биоцидная активность клеток сохраняется, а уровень их выживаемости снижается незначительно.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. А.А. Савченко — определение концепции, проведение исследования; Е.Н. Анисимова — визуализация, написание черновика рукописи; Е.А. Царькова — проведение исследования; А.Г. Борисов — работа с данными, анализ данных, написание черновика рукописи. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Исследование одобрено локальным комитетом по биоэтике ФИЦ КНЦ СО РАН НИИИ МПС (протокол № 11 от 13 ноября 2023 г.).

Согласие на публикацию. Все участники исследования до включения в исследование добровольно подписали форму информированного согласия, утверждённую в составе протокола исследования этическим комитетом.

Источники финансирования. Отсутствуют.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Редакционная политика в отношении совместного использования данных к настоящей работе не применима, новые данные не собирали и не создавали.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовал один внешний рецензент и один член редакционного совета.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: A.A. Savchenko: conceptualization, investigation; E.N. Anisimova: visualization, writing—original draft; E.A. Tsarkova: investigation; A.G. Borisov: data curation, formal analysis, writing—original draft. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: The study was approved by the Local Bioethics Committee of the Krasnoyarsk Science Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Research Institute for Medical Problems in the North (Protocol No. 11, November 13, 2023).

Consent for publication: All participants provided written informed consent form approved by the Ethics Committee as part of the study protocol prior to inclusion in the study.

Funding source: No funding.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: The editorial policy regarding data sharing does not apply to this work, and no new data was collected or created.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved an external reviewer and a member of the editorial council.

About the authors

Andrei A. Savchenko

Krasnoyarsk Science Centre of the Siberian Branch of Russian Academy of Science

Email: aasavchenko@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5829-672X
SPIN-code: 3132-8260

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, 3G Partizana Zheleznjaka st, Krasnoyarsk, 660022

Elena N. Anisimova

Krasnoyarsk Science Centre of the Siberian Branch of Russian Academy of Science

Author for correspondence.
Email: foi-543@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6120-159X
SPIN-code: 4610-7610

MD, Cand. Sci. (Medicine), Assistant Professor

Russian Federation, 3G Partizana Zheleznjaka st, Krasnoyarsk, 660022

Elena A. Tsarkova

Medical Clinic “AxioMed”

Email: service@axiomed.ru
SPIN-code: 5202-6035
Russian Federation, Serpukhov

Alexandr G. Borisov

Krasnoyarsk Science Centre of the Siberian Branch of Russian Academy of Science

Email: 2410454@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9026-2615
SPIN-code: 9570-2254

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, 3G Partizana Zheleznjaka st, Krasnoyarsk, 660022

References

Supplementary files